论文部分内容阅读
目的:镧（lanthanum,La）是稀土元素（rare earth elements,REEs）的代表元素,在人体中可以蓄积。研究发现La可以通过血脑屏障在大脑中蓄积,影响微量元素的分布,促进氧化应激、干扰神经递质。研究证据表明La可引起神经元形态和结构异常、影响中枢神经系统发育、改变神经行为、损伤学习记忆能力。故La具有明显的神经毒性作用,然而目前La影响神经中枢的的神经毒作用机制仍未得到完全阐明。小胶质细胞属于中枢神经系统的免疫细胞,呈分枝状分布于大脑和脊髓,监控着周围的环境变化。当中枢神经系统处于感染、炎症、创伤和缺血等病理状态时,小胶质细胞被激活,从分枝状迅速转变为阿米巴状,并通过释放各种生物因子（例如促炎细胞因子和活性氧等）损害神经系统。经典细胞焦亡是一种新型的细胞程序性死亡方式,由炎性半胱氨酸蛋白酶介导。炎性半胱氨酸蛋白酶-1（Systeinyl aspartate-specific protease-1,Caspase-1）在炎性小体激活下特异性对消皮素D（Gasdermin D,GSDMD）蛋白进行切割,切割下的GSDMD-N端片段（N-terminal fragment of GSDMD,GSDMD-N）与质膜相结合并发生寡聚化,导致细胞膜上形成孔隙,细胞发生肿胀至破裂,释放出细胞内容物,分泌炎性因子IL-1β和IL-18,导致细胞焦亡,诱发级联炎症反应。研究La对小胶质细胞焦亡的影响对于阐明神经毒性因子所致神经系统病理损害的机制具有着重要意义。研究方法:1.小鼠小胶质细胞系（BV2细胞）购自吉尼欧生物公司,使用DMEM高糖培养液（含10%胎牛血清,1%青霉素和链霉素）,在5%CO2、37℃条件下常规培养细胞。2.通过CCK8法检测La Cl3处理BV2细胞存活率,确定La Cl3染毒的剂量和时间;培养细胞至70%～80%融合时,弃去培养液,PBS轻轻洗一遍,加入预先用DMEM配制好的0 m M、0.025 m M、0.05 m M、0.1 m M La Cl3溶液,处理24h后收取细胞培养液或细胞团块进行后续的实验;或加入以DMEM配制好的含SYK抑制剂R406的La Cl3溶液处理BV2细胞24h,然后收取细胞培养液或细胞团块进行后续的实验。3.成像显微镜观察各剂量La处理下BV2的细胞形态;4.免疫荧光法检测La处理BV2细胞后,其激活标识蛋白IBA-1的荧光强度;5.ELISA法检测La处理后BV2细胞释放IL-1β、IL-18情况变化;6.Western Blot法检测由TREM-1及SYK激酶调控的通路上游相关蛋白TREM-1、SYK、Lyn、Pyk2、p-Pyk2蛋白表达情况;7.Western Blot法检测经典焦亡通路相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD的表达情况。8.免疫荧光法检测La处理BV2细胞后焦亡蛋白GSDMD的荧光强度变化;9.CCK8法确定SYK激酶抑制剂R406的使用剂量;10.Western Blot法检测添加SYK抑制剂R406后,SYK、Pyk2、p-Pyk2蛋白表达水平;11.Western Blot法检测添加SYK抑制剂R406后,经典焦亡通路相关蛋白NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD的表达情况;12.ELISA法检测添加SYK激酶抑制剂R406后,BV2细胞释放IL-1β、IL-18情况变化。结果:与对照组比较,La Cl3处理组细胞存活率降低,随着La Cl3处理剂量的上升而逐渐下降;不同剂量La Cl3处理组BV2细胞与对照相比,小胶质细胞呈活化状态,细胞四周折光性变强,丝状伪足增多并延长,随着染La Cl3剂量增加,IBA-1蛋白的荧光强度逐渐增加,活化的形态更加明显;La Cl3处理组的BV2细胞培养液中的IL-1β、IL-18含量较对照组明显增多,且差异有统计学意义;与对照组相比,La Cl3处理组的BV2细胞TREM-1、SYK、Lyn、p-Pyk2,NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD的表达水平增加,但Pyk2总蛋白的表达水平不变;与对照组相比,随着La Cl3剂量增加,GSDMD蛋白的荧光强度逐渐增加;使用500 n M R406处理细胞后,La Cl3处理组的BV2细胞培养液中的IL-1β、IL-18含量较单纯0.1m M La Cl3处理组减少,且差异具有统计学意义;与单纯0.1 m M La Cl3处理组相比较,0.1 m M La Cl3+500 nm R406组BV2细胞TREM-1、SYK、Lyn、p-Pyk2,NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、GSDMD的表达水平明显下降,且差异具有统计学意义。结论:1.La引起BV2小胶质细胞TREM-1过度表达并导致SYK激酶调控的下游的关键蛋白表达异常,伴随炎性因子的过度释放,引起细胞焦亡。2.R406对La所致BV2小胶质细胞焦亡、炎性因子过度释放具有一定的拮抗作用。