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肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7是一种广泛传播,且会导致患者出现如腹泻和肠道炎症等轻症,或溶血性结肠炎和溶血性尿毒综合症等重症的病原体。然而O157:H7对其宿主如牛、猪等并不具有毒力感染和致病性,而食源性感染是O157:H7感染人的主要途径。研究发现,低剂量的O157:H7(～102)经口鼻食源性感染即能克服胃内极端酸胁迫且成功进入肠道感染宿主,这主要归功于其强大的耐酸性(Acid resistance,AR)。在过去的几十年中,一些重要的大肠杆菌AR机制已被发现,如全局压力调控因子RpoS调控的AR-I和多种氨基酸依赖的AR-Ⅱ系统。值得注意的是,目前还发现一些潜在的AR调控系统和分子,如I型群体感应(Quorumsensing,QS)信号分子酰基高丝氨酸内酯(Acyl homoserine lactone,AHL)可以调控谷氨酸AR系统谷氨酸脱羧酶编码基因gadA的表达,但调控机制有待探索。鉴此,本研究深入探究了AHL对肠道致病性大肠杆菌O157:H7 EDL933耐酸性的影响和相关调控机制。首先,通过外源添加和内源合成AHL对O157:H7在极端酸环境下(pH=2.5)的存活率的进行探究。耐酸性实验结果显示,外源性AHL浓度(10μM和100μM)都可以不同程度显著提高O157:H7菌株的存活率(最低上调倍数约4倍,最高上调倍数约20倍),在此基础上,进一步分析AHL种类和浓度对耐酸性的影响,发现在酸处理2h和3h后,3碳位置含有羰基的AHL分子3-oxo-C6-HSL对存活率的增强倍数相较于C4-HSL和C6-HSL明显,普遍高1.5-2.5倍左右。不同AHL浓度对耐酸性的激活程度也有显著性差异,相对于10μM 3-oxo-C6-HSL,在酸处理1h和2h,100μM3-oxo-C6-HSL也可以显著提高该肠道病原大肠杆菌的存活率约3.3倍和3.78倍。由于大肠杆菌缺乏AHL合成酶,本研究将小肠结肠炎耶尔森氏菌的AHL合酶基因yen1导入O157:H7,验证其能成功合成AHL后,耐酸实验结果显示,AHL合成重组菌O157:H7 EDL933/pyenI,相较于野生株O157:H7 EDL933的存活率在酸处理3h后升高约16.7倍。但外源AHL却不能增强禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic E.coli,APEC)的酸性存活率。上述研究表明AHL对致病性肠道大肠杆菌O157:H7的耐酸应答有调控作用,而对肠道外致病性大肠杆菌并无显著影响。这种AHL调控下由EHEC EDL933和APEC CE129展现的耐酸性差异目前并无可利用的研究来解释。但由于两种菌株作用部位的不同,猜测可能与生存环境的不同导致的基因组进化差异有关。随后,利用RT-PCR和Western bolt检测技术进一步测试了 AHL对AR的调控。结果发现在非酸性环境(pH=7.0)和酸性环境(pH=2.5)下,AHL可以显著增强AR-I系统调控基因rpoS和AR-Ⅱ系统中谷氨酸脱羧酶编码基因gadA的表达水平,表明AHL对rpos和gadA基因的调节是其调控大肠杆菌耐酸性的通路之一。随后检测了AHL的受体促细胞分裂因子(suppressor of division inhibitor,SdiA)在耐酸通路的作用。在正常pH下,AHL受体SdiA转录水平受AHL影响轻微(约上调1.5倍),而酸性pH下添加AHL则使sdiA转录被显著上调约7倍,单独酸性刺激(无AHL)则会降低sdiA的表达,这表明sdiA基因的功能性激活需要酸性pH和AHL两个条件共同作用。为进一步检验AHL-SdiA对RpoS和GadA的调控机制,本研究构建了sdiA缺失株EDL933ΔsdiA,耐酸实验结果显示EDL933ΔsdiA的酸性存活率显著下降,同时,gadA和rpoS的表达也都减少,这表明AHL在酸性胁迫下可能通过sdiA激活gadA和rpoS。然而,外源添加AHL却能激活EDL933ΔsdiA的gadA和rpoS基因的转录与蛋白表达,这表明除SdiA外,一些未知的其它因子可能参与到了 AHL对大肠杆菌的耐酸性的调控。通过构建EDL933ΔrpoS,检测RpoS在AHL所调控耐酸通路中的作用,耐酸性实验中EDL933ΔrpoS存活率下降至42%,外源AHL不能有效恢复ΔrpoS的酸性存活率,这表明RpoS的存在对于AHL调控的耐酸应答至关重要。rpoS缺失导致gadA的表达下降至74.4%,但AHL添加却能恢复gadA转录至正常水平以上,提示AHL并不是通过激活rpoS来进一步调控gadA的表达。本研究探究了 AHL种类和浓度对肠道致病性大肠杆菌EDL933耐酸性的调控作用,发现AHL能通过其受体SdiA,全局压力调控子RpoS和谷氨酸脱羧酶GadA调控致病性肠道大肠杆菌耐酸性的分子机制。本研究提示EHEC与食物或胃中其他细菌的混合感染有助于EHEC通过窃听环境中AHL分子以增强其耐酸机制或其它生理功能。