【摘 要】
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南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf disease virus,SRBSDV）为呼肠孤病毒科（Reoviradae）斐济病毒属（Fijivirus）确定种,该病毒由白背飞虱传播,侵染水稻引致植株矮化、叶色深绿、叶片卷曲、分蘖增多及高节位分蘖等症状。自2001年在广东阳西县首次发现以来,SRBSDV基因组结构和基因功能的研究取得了明显的进展。本
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南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf disease virus,SRBSDV）为呼肠孤病毒科（Reoviradae）斐济病毒属（Fijivirus）确定种,该病毒由白背飞虱传播,侵染水稻引致植株矮化、叶色深绿、叶片卷曲、分蘖增多及高节位分蘖等症状。自2001年在广东阳西县首次发现以来,SRBSDV基因组结构和基因功能的研究取得了明显的进展。本实验室前期研究中,通过小RNA（small RNAs,sRNAs）测序发现大量SRBSDV来源的小干扰RNA（Virus derived small interfering RNA,vsiRNA）,其大小主要为21-22 nt,无正负链偏好性,这些vsiRNAs可能干扰寄主植物基因的表达。本研究通过对小RNA和降解组测序数据进行关联分析,筛选作用于水稻的vsiRNA及其靶基因,利用分子生物学手段验证两者间的互作,试图揭示vsiRNA在病害症状形成中的作用,以期加深对病毒致病机理的认识。获得如下研究结果:1、进一步明确了感病水稻植株中SRBSDV来源的vsiRNA分子特征。在40 dpi的感病水稻植株中,SRBSDV来源的vsiRNA长度主要以21 nt和22 nt为主,无正负链偏好性,5’端碱基主要为U和A。这些特征与14和28 dpi基本相一致。2、vsiRNA数据与降解组数据关联分析发现3个高度可能靶向水稻基因的vsiRNAs。以vsiRNA reads≥70且靶基因降解片段reads≥10为标准,筛选到3个较高丰度积累的vsiRNA（vsiR-S6-10、vsiR-S9-18和vsiR-S3-5）,它们可能靶向水稻SAP（LOC＿Os10g13630.1）、ROC1（LOC＿Os08g08820.1）和TM（LOC＿Os01g72009.1）基因,在降解组数据中,这3个预测靶基因的mRNA降解片段reads分别为50,33和14。3、对vsiRNA靶向的3个水稻候选基因进行了生物信息学分析。结果表明,vsiRS6-10靶向的SAP基因编码包含SAP结构域的蛋白,预测其与DNA结合相关,可能具有转录因子功能;vsiR-S9-18靶向的ROC1基因包含homeobox和START结构域,推测可能在水稻生长发育中起转录调控作用;vsiR-S3-5靶向的TM基因,推测其编码跨膜运输相关蛋白。4、对3个vsiRNA的积累量及其靶基因的表达量进行了检测。结果表明,感病水稻在20 dpi和40 dpi时,vsiR-S6-10、vsiR-S9-18和vsiR-S3-5均有较高水平的积累,其对应的靶基因的表达均在一个或多个病程点显著下调。5、利用水稻原生质体和烟草瞬时共表达系统验证了vsiRNA对水稻靶基因表达的调控作用。在表达vsiR-S6-10和vsiR-S9-18的水稻原生质体中,其预测靶基因SAP和ROC1表达量分别下调了30.3%和38.6%,但vsiR-S3-5在原生质体中没有检测到其对预测靶基因TM有调控作用。在vsiR-S6-10和SAP共表达,以及vsiR-S9-18和ROC1共表达的本生烟细胞中,均发现了vsiRNA对其预测靶基因的表达具有抑制作用,当靶基因与vsiRNA匹配区域发生核苷酸突变后,这种抑制作用即丧失,但在该系统中,vsiR-S3-5仍未表现对预测靶基因TM有调控作用。6、激光共聚焦显微镜观察vsiRNA靶基因的亚细胞定位。结果表明,SAP蛋白为细胞核质共定位,ROC1蛋白为细胞核定位。7、采用基因编辑技术培育了vsiRNA靶基因的突变体,证实靶基因SAP和ROC1的突变可引致水稻矮化、分蘖增多和根系发育不良的表型表型。vsiR-S6-10预测靶基因SAP的两个突变体株系均表现出与SRBSDV病害症状类似的植株矮化和分蘖增多的表型;vsiR-S9-18预测靶基因ROC1的两个突变体株系均表现出根系发育不良的表型。综上,本研究发现并基本证实了SRBSDV来源的vsiR-S6-10和vsiR-S9-18分别序列特异性地靶向水稻基因SAP和ROC1,降解靶基因的mRNA,在病害症状形成中起重要作用。这是迄今为数不多的vsiRNA靶向寄主基因参与植物病毒致病的研究结果,可望为深入揭示植物病毒致病机制及筛选评价植物抗病性提供指引。
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