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实验背景:传统典型手足口病(Hand foot and mouth disease,HFMD)通常由肠道病毒71(Enterovirus 71,EV 71)或柯萨奇病毒A16(Coxsackievirus A16,CA16)引起,而非典型手足口病通常由柯萨奇病毒A6(Coxsackievirus A6,CA6)引起。近年来与CA6相关的非典型手足口病发病率越来越高,但对其致病机制的了解仍然非常有限。坏死性凋亡(Necroptosis,亦称为程序性坏死)是一种不同于坏死(Necrosis)或凋亡(Apoptosis)的细胞死亡途径,前期研究中我们发现感染CA6可促进细胞死亡,这与感染EV71后促进细胞凋亡明显不同,我们猜测CA6有可能通过坏死性凋亡途径诱导宿主细胞死亡。本研究探讨CA6具体致病机制,为CA6引发的相关疾病提供新的治疗策略及药物治疗靶点。实验方法:采用对CA6敏感的人恶性横纹肌肉瘤细胞(RD细胞)作为宿主细胞。第一步,用CA6或EV71感染宿主细胞,通过细胞计数、形态学观察及大分子细胞核染料碘化丙啶(PI)染色比较二者诱导的宿主细胞病变区别,初步评估CA6诱导的细胞死亡特征。第二步,用坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1或凋亡Caspase-3(胱天蛋白酶-3)抑制剂(Z-DEVD-FMK)分别干预CA6或EV71感染的细胞,通过PI染色法及形态学观察,进一步检测两个通路抑制剂对CA6诱导细胞损伤的干扰作用,初步确定CA6致病机制。第三步,用Necrostatin-1或Z-DEVD-FMK处理CA6或EV71感染的细胞,用细胞计数法测细胞存活率,Western Blot法和蛋白免疫荧光染色法检测坏死性凋亡通路蛋白:RIPK3(受体相互作用蛋白激酶-3)、MLKL(混合谱系激酶结构域蛋白)和P-MLKL(磷酸化混合谱系激酶结构域蛋白);凋亡通路蛋白:Pro-caspase-3(胱天蛋白酶-3前体蛋白)和Caspase-3(胱天蛋白酶-3);VP1(病毒结构蛋白)表达水平等指标变化,进一步比较两类抑制剂对CA6或EV71诱导细胞死亡的作用区别,初步确定CA6的致病机制。第四步,研究编码坏死性凋亡通路蛋白RIPK3的小分子干扰RNA(SHRNA)及过表达质粒对CA6诱导的细胞死亡的影响。第五步,研究坏死性凋亡对CA6病毒生成的影响(VP1蛋白水平、m RNA水平、病毒毒力、病毒释放)的影响。以及Necrostatin-1抑制病毒增殖的情况。最后,研究CA6病毒诱导细胞死亡的具体机制。首先通过流式细胞术检测ROS水平。再将ROS清除剂NAC(N-乙酰-L-半胱氨酸)应用于感染CA6的细胞,探究ROS清除剂对感染CA6细胞的干预作用。接着,用CA6的3D和3C质粒转染细胞,检测RIPK3蛋白表达水平及其与3D、3C蛋白分子间的相互作用及共定位,探究3D蛋白或3C蛋白在CA6诱导的细胞死亡中起的作用。结果与分析:1.CA6诱导的细胞病变与诱导凋亡途径的EV71不同。2.坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1可逆转由CA6诱导的细胞死亡,而凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK无此作用。3.CA6感染后细胞坏死性凋亡标志性蛋白RIPK3表达呈感染时间依赖性上调,且上调的趋势与病毒结构蛋白VP1相似,而RIPK3下游蛋白MLKL和P-MLKL的表达并没有随之改变。CA6感染后凋亡通路标志性蛋白Pro-caspase-3和Caspase-3表达水平没有改变。坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1可逆转CA6诱导的RIPK3、VP1蛋白表达上调。4.RIPK3的SHRNA可降低RIPK3表达水平,抑制CA6 VP1蛋白表达;RIPK3的过表达质粒促进CA6增殖和其诱导的坏死性凋亡。5.CA6诱导的坏死性凋亡影响病毒增殖。(1)坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1和Necrostatin-2均以剂量依赖性方式降低CA6病毒的VP1蛋白表达水平。(2)Necrostatin-1和Necrostatin-2均降低CA6病毒基因组水平。Necrostatin-1(150μM)干预组(Nec-1)的VP1 m RNA水平降至0.41±0.02(P<0.001),Necrostatin-2(180μM)干预组(Nec-2)的VP1 m RNA水平降至0.05±0.00(P<0.001)。(3)坏死性凋亡抑制剂降低CA6病毒毒力。TCID50结果显示:加入Necrostatin-1(150μM)干预组(Nec-1)TCID50/ml为4.66±0.81×10~5,比对照组(Con)TCID50/ml 45.27±16.16×10~5降低十倍(P<0.05);加入Necrostatin-2(180μM)干预组(Nec-2)TCID50/ml 3.68±0.37×10~5比起对照组(Con)TCID50/ml 31.09±9.26×10~5也显著降低。(4)坏死性凋亡抑制剂影响CA6病毒释放,而抑制病毒增殖。用Necrostatin-1(150μM)干预CA6感染的细胞。结果显示,无论是VP1m RNA水平还是TCID50/ml,细胞外对照组(Con)均远高于Necrostatin-1干预组(Nec-1)(123倍,P<0.001;229倍,P<0.001),而细胞内的差异没有如此明显。由此可见,Necrostatin-1主要通过抑制病毒释放而抑制病毒增殖。6.CA6的3D蛋白直接劫持RIPK3诱导坏死性凋亡,取代传统ROS依赖性性坏死性凋亡通路。(1)CA6诱导的坏死性凋亡与ROS无关。流式细胞术结果显示比起对照组,CA6感染组ROS水平并未升高。形态学特征及PI染色、VP1蛋白表达及TCID50结果均显示NAC不影响CA6诱导的细胞死亡。(2)CA6的3D蛋白直接劫持RIPK3蛋白诱导坏死性凋亡。用CA6的3D和3C质粒转染293T细胞36 h,蛋白免疫共沉淀分析结果显示:RIPK3蛋白抗体能够下拉3D-HA,但不能下拉标签蛋白HA;而RIPK3蛋白抗体无法下拉3C-HA。Western Blot及蛋白免疫荧光染色结果显示:与空载体对照组比较,3D组RIPK3蛋白表达量显著上调,并且RIPK3与3D-HA共定位,但不与HA共定位。用3D转染RD细胞,RIPK3蛋白表达量相应上调,坏死性凋亡细胞数与3D质粒转染剂量呈正相关。结论:1.CA6可以上调宿主细胞的RIPK3蛋白表达诱导坏死性凋亡,传统的下游坏死性凋亡执行蛋白MLKL和P-MLKL蛋白表达水平不受CA6影响。2.CA6诱导的坏死性凋亡与ROS无关,而是由CA6编码的非结构蛋白3D直接劫持RIPK3诱导坏死性凋亡,并且3D蛋白可上调RIPK3。此外3C蛋白不与RIPK3结合。3.坏死性凋亡抑制剂(Necrostatin)可以抑制CA6诱导的RIPK3表达水平上调,抑制坏死性凋亡。4.CA6诱导的坏死性凋亡可以促进病毒释放,进而促进病毒增殖。Necrostatin-1可抑制CA6诱导的坏死性凋亡,抑制病毒释放,抑制病毒增殖。创新点:1.首次发现非典型手足口病病毒CA6的致病机制为诱导宿主细胞发生坏死性凋亡,这为寻找非典型手足口病靶点药物提供了新的思路。2.首次发现CA6通过3D蛋白直接劫持坏死性凋亡依赖性蛋白RIPK3而诱导坏死性凋亡,这是不依赖于ROS的新型诱导坏死性凋亡机制。3.Necrostatin-1可抑制CA6诱导的RIPK3蛋白表达水平上调,抑制CA6诱导的宿主细胞坏死性凋亡。4.首次发现CA6诱导的细胞坏死性凋亡可促进病毒释放,进而促进病毒增殖。Necrostatin-1可抑制坏死性凋亡,从而抑制病毒释放,抑制病毒增殖。这提示Necrostatin-1可作为非典型手足口病的治疗药物。