犬副流感病毒分子克隆的构建及微型基因组建模

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犬副流感病毒(canine parainfluenza virus,CPIV)是引起犬的自限性气管支气管炎,犬窝咳的主要病因。临床上,CPIV单独感染不引起致死性疾病,只表现为温和的呼吸道症状,而这种情况并不常见;常见的是CPIV与其他病原的混合感染,使病情加剧,大幅度提高死亡率。自1967年首次分离得到该病毒以来,世界各地陆续有相关报道,目前该病毒感染范围已波及全世界,在我国亦出现了普遍流行趋势。在各类病毒疫苗的开发研究中,最为重大的科学进展是反向遗传技术。目前,CPIV的基因工程疫苗尚未见报道,但对人副流感病毒(human parainfluenza virus,HPIV)和牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus type3,BPIV3)已有较多的研究。随着负链RNA病毒反向遗传学技术的日趋成熟,副流感病毒(parainfluenza virus,PIV)作为活病毒表达载体方面有广阔的应用前景,HPIV和BPIV3的现有研究成果对CPIV的研究有借鉴意义。本实验室以构建CPIV的感染性分子克隆为目的。根据Gen Bank(KC237064.1)中PIV5 1168-1毒株序列设计引物,应用RT-PCR法对购自ATCC的CPIV HRB-V病毒株分段扩增,克隆到pHW2000载体中并进行测序,经序列拼接获得全基因组序列。与Gen Bank登录的PIV代表毒株进行对比分析。基因序列分析表明,HRB-V株基因组全长15246nt,含5’-末端、3’-末端和7个ORF,具有PIV基因组结构的典型特征;将结构蛋白F、HN以及全基因序列与参考毒株进行比较分析并做遗传进化树,结果表明:HRB-V与CPI-和CPI+属同一分支,亲缘性相近。同源性分析结果表明:HRB-V与各病毒株的F基因的核苷酸同源性在96.5%~98.8%之间,氨基酸同源性为94.2%~98%;HN基因的核苷酸同源性在98.1%~99.5%之间,氨基酸同源性为97%~99.3%。本研究系统了解了CPIV的基因组结构及遗传进化特点。参考已知的HRB-V病毒株序列设计引物,RT-PCR扩增NP、P和L基因,分别克隆入真核表达载体pCI-neo中,构建辅助质粒;同时使eGFP取代病毒整个编码区,只保留两个末端与病毒复制、转录和病毒粒子包装相关的调控序列,将其反向克隆入转录载体pVAX1中,构建该病毒的微型基因组质粒,应用此微型基因组对辅助质粒的表达产物进行功能鉴定。结果表明NP、P和L三种蛋白的正常表达并发挥RNA聚合酶作用,为病毒拯救奠定基础。本研究成功构建了CPIV的分子克隆,并进行系统分析;同时构建了病毒辅助质粒及微型基因组,鉴定了辅助质粒的RNA聚合酶功能。以上研究为实验室构建CPIV反向遗传操作技术平台奠定基础。
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