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[研究背景及目的]动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)引起的心血管疾病(cardiovascular diseases,CVD)是全球居民疾病死亡的首要原因。炎症反应和细胞死亡在动脉粥样硬化的发生发展中扮演重要作用。近年来研究报道细胞焦亡(pyroptosis)作为一种与炎症相关的细胞死亡形式参与了动脉粥样硬化的病理过程。因此,对细胞焦亡过程的干预和调节可能是动脉粥样硬化性疾病防治的新的切入点。长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)可在多个层面调控基因的表达,其表达水平的异常在包括动脉粥样硬化在内的多种疾病的病理过程中发挥重要作用。近年来一些研究表明,lncRNA与细胞焦亡信号通路中的相关分子的表达异常有关,从而影响多种疾病的进程。新近的研究显示,lncRNAMALAT1是一种促细胞焦亡的lncRNA。内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化发生的最早环节。因此,维持内皮细胞的完整性及正常功能对防治动脉粥样硬化至关重要。LncRNAMALAT1作为一种在内皮细胞高表达的lncRNA,其对于动脉粥样硬化密切相关的内皮细胞的焦亡作用及机制目前尚未见报道。研究lncRNAMALAT1在内皮细胞焦亡中的作用可能帮助我们更好的理解动脉粥样硬化的发病机制,甚至可能帮助我们找到动脉粥样硬化性疾病防治的新突破点。动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病,炎症小体活化在无菌性炎症过程中发挥重要作用。研究显示,Nod样受体蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体参与了动脉粥样硬化的发生发展。高血糖是动脉粥样硬化的重要危险因素,颈动脉是反映全身动脉粥样硬化的一个窗口。目前关于lncRNAMALAT1和NLRP3在2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化(Carotid atherosclerosis,CAS)中的表达水平及意义少有研究报道。基于以上背景,本研究选择高血糖这一动脉粥样硬化发生发展中的危险因素以及细胞焦亡发生的诱导因素作为刺激物,从临床样本、细胞及分子水平来研究lncRNAMALAT1在动脉粥样硬化中的作用,探讨其在葡萄糖诱导下对内皮细胞焦亡的调控,并探索其可能的机制。力求揭示lncRNAMALAT1通过对内皮细胞焦亡的调控参与动脉粥样硬化斑块发生发展过程的作用。[方法]临床样本研究:据颈部血管超声检查结果依据曼海姆颈动脉内-中膜厚度和斑块共识以及《血管超声检查指南》将87例2型糖尿病患者分为单纯2型糖尿病组(n=26例)和2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化组(n=61例),将2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化组又分为颈动脉内中膜增厚和颈动脉粥样硬化斑块形成亚组,收集外周血,分析各组患者间的临床资料差异。通过实时荧光定量PCR检测各组中lncRNAMALAT1和NLRP3的基因表达水平,并分析二者的相关性。细胞实验:培养EA.hy926人脐静脉内皮细胞,使用不同浓度葡萄糖刺激细胞,收集不同时间点(Oh、12h、24h和48h)细胞进行检测,采用FISH杂交检测lncRNA MALAT1在内皮细胞中的表达部位,通过实时荧光定量PCR检测lncRNA MALAT1的表达变化。高糖(33mmol/L葡萄糖)处理内皮细胞48h,收集不同时间点的细胞,通过Hoechst 33342/PI荧光双染和LDH释放水平评估细胞死亡情况,采用实时荧光定量PCR检测焦亡相关分子(NLRP3、ASC)和炎症因子(IL-1β、IL-6和TNFα)的mRNA表达,使用免疫荧光检测焦亡相关分子(NLRP3、ASC)的表达情况。采用ASO沉默EA.hy926内皮细胞中lncRNA MALAT1的表达,高糖处理细胞,Hoechst 33342/PI荧光双染和LDH释放水平评估细胞死亡情况,通过实时荧光定量PCR检测lncRNAMALAT1的表达水平,采用western blot检测细胞焦亡相关分子(NLRP3、ASC、C-caspase1、IL-1β)的蛋白表达水平。生物信息学预测lncRNAMALAT1作为ceRNA结合的靶标miR-22,采用双荧光素酶报告实验验证miR-22同lncRNAMALAT1的结合作用。转染miR-22 mimics或阴性对照,实时荧光定量PCR检测对于lncRNAMALAT1表达水平的影响;转染ASO-MALAT1或阴性对照,实时荧光定量PCR检测对于miR-22表达水平的影响。采用高糖处理内皮细胞,实时荧光定量PCR检测不同时间点miR-22的水平变化。转染ASO-MALAT1或阴性对照后,高糖处理EA.hy926内皮细胞,过表达miR-22,采用Hoechst 33342/PI荧光染色检测细胞死亡情况,通过western blot检测焦亡相关分子的蛋白表达水平。[结果](1)2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化患者外周血单核细胞中lncRNAMALAT1和NLRP3基因的表达较单纯2型糖尿病患者显著增高(P<0.05);在2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化组的患者中具有颈动脉粥样硬化斑块者lncRNAMALAT1和NLRP3基因的表达比单纯2型糖尿病明显增高;(2)2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化斑块形成患者外周血中lncRNAMALAT1表达水平与NLRP3基因表达水平呈正相关;(3)葡萄糖刺激EA.hy926人脐静脉内皮细胞后,lncRNA MALAT1表达水平以时间依赖和浓度依赖的方式增高;(4)高糖可以诱导EA.hy926人脐静脉内皮细胞发生焦亡;(5)下调lncRNAMALAT1减轻了高糖诱导的EA.hy926人脐静脉内皮细胞的焦亡;(6)生物信息学预测到lncRNAMALAT1包含了miR-22的潜在结合位点,双荧光素酶报告实验证实lncRNAMALAT1与miR-22的结合;(7)miRNA-22是lncRNAMALAT1的下游靶标;(8)过表达miR-22减轻lncRNAMALAT1对高糖诱导的内皮细胞焦亡的影响。[结论](1)lncRNAMALAT1和NLRP3基因表达水平在2型糖尿病合并颈动脉粥样硬化斑块形成患者中显著增高;(2)lncRNAMALAT1通过竞争性结合miR-22从而促进NLRP3的表达来调控高糖诱导的内皮细胞的焦亡,为动脉硬化性疾病提供防治的理论依据。