miRNA-378转基因小鼠的制备、检测及表型初步分析

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miRNA对细胞的增殖和分化以及不同阶段的肌肉发育都有着十分重要的调节作用,本研究构建了猪miRNA-378过表达载体,通过转染猪胎儿成纤维细胞系(PEF,porcine embryo fibroblast),在细胞水平验证过表达载体的表达效率。利用原核显微注射技术制备转基因小鼠,通过分子生物学方法分析转基因小鼠的整合效率及表达效率,并对miRNA-378在转基因小鼠上的生物学功能进行初步分析。从大白猪(sus scrofa)基因组的DNA上扩增miRNA-378扩增前体序列,通过XhoI酶切后回收相应片段,连接到pEGP-miR载体中,成功构建重组载体pEGP-miR-378并转染猪胎儿成纤维细胞系(PEF,porcine embryo fibroblast),通过荧光观察转染效率及报告基因的表达效率,利用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)测定细胞内miRNA-378的表达活性。结果表明,成功构建了重组载体pEGP-miR-378;荧光观察转染后的细胞,显示有较高的转染效率,报告基因有较高的表达效率;QRT-PCR结果显示,试验组较对照组miRNA-378表达显著提高,试验组较对照组细胞间差异极显著(p<0.01);为制备转基因动物研究miRNA-378功能提供技术平台。通过原核显微注射方法制备miRNA-378过表达转基因小鼠,结合PCR方法和Southern blot方法检测获得阳性转基因小鼠,作为Founder小鼠。以Founder小鼠为基础利用全同胞交配法进行后代小鼠的扩繁培育,经PCR、QRT-PCR检测,共获得的77只后代小鼠,其中48只小鼠为转基因小鼠,转基因阳性率为62.3%,经检测转基因小鼠的外源基因整合到染色体上在后代的扩繁培育中外源基因稳定的遗传;应用活体成像技术,转基因小鼠在蓝色光源的激发下检测出绿色荧光;小鼠的体重自断奶(第3周)开始至第10周进行每周体重记录,发现某些转基因小鼠家系与非转基因小鼠家系在生长速度上有相对的加快且体重上有所增加。该模型的建立获得了生长速度相对较快、体重增加的转基因小鼠,为今后研究miRNA-378的生物学功能奠定了良好的基础。
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