论文部分内容阅读
梨为蔷薇科（Rosaceae）梨属（Pyrus）植物,其栽培历史悠久,具有重要的经济价值和食用价值,是我国重要的果树之一。杜梨作为梨的主要砧木,具有耐盐碱、耐寒、耐涝、耐旱等抗性,适应性较强,在梨树生产中被广泛应用。在盐渍化程度不断严重的大环境下,杜梨的抗性作用显得更为重要。研究发现,CBL-CIPK通路中的类钙调磷酸酶B互作蛋白激酶CIPK和Na+/H+逆向转运蛋白NHX广泛参与植物对盐胁迫的调节。为了探讨杜梨对盐胁迫的响应机制,本研究从杜梨中鉴定出1个CIPK基因和16个Na+/H+逆向转运蛋白基因,初步研究了它们的基因结构、序列特征、表达特点和离子含量的关系;并对其中2个盐胁迫响应的Na+/H+逆向转运蛋白基因进行功能探究。本论文的主要研究结果如下:（1）本文克隆和鉴定杜梨响应盐胁迫的PbCIPK1基因,通过生物信息学和实时荧光定量PCR技术分析了该基因的序列特征以及在盐处理下的表达模式。该基因全长为1368 bp,含有1365 bp的开放阅读框,编码455个氨基酸,DNA序列为5051 bp,包含12个外显子和11个内含子。实时荧光定量PCR分析结果表明,该基因在杜梨的叶片中表达量最高,且受盐胁迫的诱导下调表达。（2）结合已公布的梨基因组数据,以及拟南芥相关数据,通过生物信息学手段,鉴定杜梨NHX基因家族成员;通过MEGA7.0软件进行序列比对及进化分析;通过在线工具Pfam、SMART以及GSDS进行基因结构分析;通过定量PCR技术分析非生物胁迫下基因在不同组织中的表达特征。通过火焰石墨炉原子吸收光谱仪测定NaCl胁迫下杜梨不同组织中Na+与K+的含量。成功鉴定出16个候选基因,其中有4个基因属于NHX基因亚家族,4个基因属于CHX基因亚家族,8个基因属于KEA基因亚家族。候选基因均含有Na+/H+Exchange功能域;NaCl胁迫下,16个基因在叶片中的表达差异大,但在8h以后均为负调控;PEG6000处理下,PbNHX1在茎中的表达量显著增高,且高于同一时期NaCl胁迫下的表达水平,仅在48 h时低于同一时期的NaCl胁迫下的表达水平;在根中,基因PbNHX12、PbNHX13、PbNHX14和PbNHX15在NaCl胁迫和PEG6000处理下在任何时间段均为负调控。盐胁迫过程中,与拟南芥NHX基因进化关系最近的PbNHX1和PbNHX11,在根和叶中呈现出负调控模式,与拟南芥KEA基因进化关系相近的PbNHX10和PbNHX7在盐胁迫过程中可能参与K+的运输。（3）在鉴定出的16个基因中,选取PbNHX7和PbNHX11这两个基因作进一步研究。通过设计引物进行PCR扩增,成功的从杜梨中克隆了这两个基因;对这两个基因进行生物信息学分析;将目的基因成功连接到过表达载体pRI201-AN-GUS上,转入拟南芥;采用PCR和GUS染色鉴定转PbNHX7和PbNHX11基因拟南芥株系;研究了转目的基因的拟南芥种子在不同盐浓度处理下的萌发率和根系生长情况;采用GUS染色分析基因的表达情况。结果表明:基因PbNHX7开放阅读框的碱基数为2298 bp,编码了 765个氨基酸;基因PbNHX11开放阅读框的碱基数为1659 bp,编码了 552个氨基酸。PCR和GUS染色结果表明,PbNHX7和PbNHX11这两个基因已经成功转入拟南芥中并表达。经不同程度盐胁迫处理后,可以明显的看出转PbNHX7和PbNHX11基因拟南芥种子的萌发率高于野生型拟南芥;转PbNHX7和PbNHX11基因拟南芥种子萌发后的根系也优于野生型拟南芥;与对照相比,经盐胁迫处理后,转基因拟南芥组织的GUS染色加深。这些结果均说明,PbNHX7和PbNHX11基因提高了拟南芥的耐盐性。