背景和目的在排除酒精和其他明确损伤肝脏的病因,肝细胞发生脂肪变性,这种临床病理综合症称为非酒精性脂肪肝病（non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD）,其发展过程包括非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver,NAFL）、非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis,NASH）、肝纤维化（Liver fibrosis）及肝硬化（Cirrhosis of the liver）。而肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSCs）的活化是纤维化发展的关键环节。普遍认为,HSCs的活化及纤维化继发于NASH的炎症过程,但我们发现在NAFLD的早期阶段（NAFL）即存在纤维化,其机制尚不清楚。在NAFL阶段由于肝细胞脂肪变性、体积增大,肝窦内压增高,肝脏血流量减少,导致肝小叶内出现缺氧微环境。有研究证明在纤维化小鼠中,HSCs被激活且HIF-1α的表达升高。那么在NAFL阶段纤维化的发生是否由缺氧引起?本文通过NAFL大鼠模型及体外细胞学模型,探讨缺氧微环境及其对HSCs活化及纤维化的影响。方法1.检测NAFL大鼠模型肝脏纤维化及缺氧微环境（1）通过HE染色,观察NAFL大鼠模型肝脏脂肪变性;（2）通过Masson染色,观察NAFL大鼠模型肝脏纤维化;（3）通过HIF-1α、α-SMA实验,检测NAFL大鼠模型HSCs活化及肝脏缺氧微环境。2.建立体外缺氧细胞学模型混合气体法（94%O2、5%CO2、1%O2）建立缺氧细胞学模型,培养原代HSCs及HSC-T6,显微镜观察对细胞形态的影响;检测HIF-1α的表达;通过免疫荧光观察HIF-1α表达及定位。3.缺氧微环境对HSCs活化及肝纤维化影响（1）研究对象及实验分组:1)研究对象:HSC-T6、大鼠原代HSCs2)实验分组:对照组:缺氧时间0 h;实验组:缺氧时间分别为4 h、12 h、24 h（2）通过CCK-8、划痕实验,研究缺氧微环境对HSC-T6增殖及迁移能力的影响;（3）通过q PCR、Western Blotting实验,研究缺氧微环境对HSC-T6、原代HSCs HIF-1α、α-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ的m RNA及蛋白表达水平的影响;（4）通过q PCR、Western Blotting实验,研究缺氧微环境对HSC-T6 YAP的m RNA及蛋白表达水平的影响。结果1.NAFL大鼠模型肝脏存在缺氧微环境及HSCs的活化（1）HE染色:NAFL大鼠模型组肝细胞内可见大量脂肪空泡（2）Masson染色:NAFL大鼠模型组肝细胞周围被胶原纤维包绕（3）IHC染色:NAFL大鼠模型HSCs HIF-1α及α-SMA的表达阳性2.体外缺氧细胞学模型的建立（1）缺氧（1%O2）培养12 h,HSC-T6、原代HSCs形态呈纺锤形转变;q PCR检测HSC-T6 HIF-1αm RNA表达升高（P＜0.05）。（2）与0 h组相比,缺氧培养HSC-T6 12 h显著促进HIF-1α分子的表达（P＜0.05）;免疫荧光化学染色证实HIF-1α主要存在于HSC-T6细胞核中,证实缺氧微环境模型建立成功。3.缺氧微环境（1%O2）对HSCs活化及肝纤维化影响（1）与0 h组相比,缺氧培养HSC-T6 4 h、12 h、24 h,4 h促进细胞增殖（P＜0.05）,而培养24 h则抑制细胞增殖（P＜0.05）;缺氧培养HSC-T6 12 h、24 h,则抑制细胞的迁移（P＜0.05）。（2）与0 h组相比,缺氧培养HSC-T6、原代HSCs 4 h、12 h、24 h,显著促进HSC-T6、原代HSCsα-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢm RNA的表达（P＜0.05）。（3）与0 h组相比,缺氧促进HSC-T6 YAP m RNA的表达水平（P＜0.05）。结论1.NAFL大鼠模型肝脏存在缺氧微环境以及HSCs的活化;2.成功建立了体外缺氧微环境细胞模型;3.缺氧微环境活化HSCs并参与NAFL纤维化过程;缺氧微环境通过Hippo/YAP信号通路活化HSCs。