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奶牛乳房炎是一种由多种致病因素引起的常见多发病,其中病原微生物感染是其最主要原因。奶牛乳房炎不仅造成奶产量和质量下降,严重的还会造成瞎奶头而导致泌乳牛过早淘汰,给奶牛养殖业造成巨大的经济损失。近些年,随着我国奶牛集约化养殖方式的推广及奶牛乳房炎防控水平的不断提高,引起奶牛乳房炎的病原菌的优势菌群及病原菌种类也发生了变化,曾经被大家认为是正常非致病菌的凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococci,CNS)的感染率显著上升,已经成为奶牛乳房炎频繁暴发和流行的主要原因之一,且由于耐药性的不断出现导致治疗难度增加。本研究对从我国部分地区15个奶牛场采集的349份临床型乳房炎奶样中分离鉴定出的75株CNS进行了生物被膜、耐药性、耐药基因及毒力基因检测,以期为明确CNS耐药性及耐药机制,指导临床治疗提供科学数据。1.采用16S rDNA测序方法对从甘肃、陕西、山西、宁夏和青海等省份15个奶牛场采集的349份临床型奶牛乳房炎样品进行细菌的分离鉴定。结果共鉴定出298株菌,主要为大肠杆菌88株、CNS 75株、金黄色葡萄球菌26株、沙雷氏菌14株、肺炎克雷伯菌13株、屎肠球菌13株和粪肠球菌9株等。75株CNS占病原菌检出率的25.2%,其中产色葡萄球菌40株(53.3%),溶血葡萄球菌16株(21.3%)、松鼠葡萄球菌6株(8.0%)、表皮葡萄球菌3株(4.0%)、木糖葡萄球菌3株(4.0%)、耳葡萄球菌2株(2.7%)、沃氏葡萄球菌2株(2.7%)、马胃葡萄球菌2株(2.7%)和头状葡萄球菌1株(1.3%)。2.采用细胞培养板法检测75株CNS生物被膜的产生情况。结果显示,86.7%(65/75)的CNS菌株能够形成生物被膜,其中形成强、中等和弱生物被膜的菌株分别占总试验菌株的6.7%、16.0%和64.0%。3.采用药敏纸片法和MIC试纸条法检测75株CNS的药物敏感性,用PCR方法检测相关耐药基因,并分析耐药性和耐药基因之间的相关性。药敏试验结果显示,75株CNS对青霉素的耐药率达56.0%,对庆大霉素、卡那霉素和四环素的耐药率均为20.0%,对CNS菌株比较敏感的药物主要有氯霉素、呋喃妥因和利奈唑胺。75株CNS对苯唑西林表型耐药率达45.3%(34/75),34株耐苯唑西林的CNS菌株MIC主要在0.5~1.5μg/mL范围内,对非β-内酰胺类药物的耐药性以CN-K-E-TE-DA的多重耐药模式为主(14.8%),82.4%(28/34)对苯唑西林耐药的CNS能产生生物被膜。耐药基因检测结果表明,在检测的CNS的耐药基因中blaZ(46.7%)的携带率最高,其次是linA(25.3%)和aac6-aph2(21.3%),tetO、tetL、tetK和ermB的检出率较低,分别为16.0%、12.0%、9.3%和10.7%。耐药性和耐药基因之间的相关性分析表明,CNS对抗生素的耐药性严重程度与其携带的耐药基因之间存在显著的正相关,即青霉素耐药性与耐药基因blaZ之间极显著相关(P<0.01);红霉素耐药性与耐药基因ermA和ermC之间极显著相关(P<0.01),与耐药基因ermB显著相关(P<0.05);四环素耐药性与耐药基因tetL之间极显著相关(P<0.01);庆大霉素和苯唑西林耐药性与耐药基因aac6-aph2和mecA之间均呈极显著相关(P<0.01)。4.采用常规PCR法对75株CNS进行毒力基因的检测。结果表明,在操纵子icaADBC中,icaC基因的检出率为17.3%,占主导地位,其次icaA和icaB基因检出率分别为1.3%和2.7%。生物被膜相关蛋白基因bap检出率为4.0%,未发现bhp基因。葡萄球菌肠毒素基因sea(28.0%)的检出率为28.0%,其次为seg(2.7%)和sei(2.7%),selm、seln、selo和selu的检出率均为1.3%,试验中未检测到毒素基因tst与luk-PV。本研究结果对指导奶牛乳房炎合理使用抗生素,减少细菌耐药性的产生,提高临床治疗效果,以及为今后深入开展牛源CNS耐药机制和致病机理研究具有重要的参考意义。