癫痫是一种临床上常见的神经系统疾病,其表现主要是由于大脑神经元反复的异常放电导致脑功能暂时性失常。其原因复杂,最近几年,研究发现癫痫发作区域会出现兴奋性神经递质的升高,突触功能改变等大脑结构和功能的变化,这些变化又可以使得癫痫呈现反复发作的特点,是癫痫频繁发作和难治的原因之一。谷氨酸受体功能异常可能是其原因之一,神经肽Y(NPY)是由36个氨基酸残基组成的多肽,广泛分布在周围神经系统和中枢神经系统,在中枢神经系统中,主要分布于丘脑、下丘脑、海马、大脑皮层等部位,而尤以海马处密度最高(Ledri M et al.,2011)。近几年研究显示NPY是一个强有力的内源性抗癫痫因子(Cardoso A et al.,2010),文献报道NPY在神经元兴奋性调节及抑制癫痫发作方面发挥着重要作用,但是至今NPY抑制癫痫发作的机制仍不十分清楚(S?rensen AT et al.,2009)。过去对其作用机制的研究大部分局限于NPY对神经元的保护作用,认为NPY主要通过Y2和Y5受体抑制突触前膜N型钙通道,使钙内流减少,导致兴奋性性递质谷氨酸释放减少,从而抑制突触后膜的兴奋性传递,发挥抑制癫痫发作的作用(Silva AP et al.,2007),至于其如何引起钙通道变化的中间环节及是否存在其他机制来发挥其抗癫痫作用,目前研究甚少。谷氨酸受体功能的变化可以导致体内兴奋性与抑制性神经递质失衡,诱发癫痫的发作及造成神经元损伤,α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(AMPA)受体是离子型谷氨酸三大受体之一,是除NMDA受体外另一类重要的兴奋性氨基酸特异性受体,它主要介导快速的兴奋性递质传递(Savtchouk I et al.,2011),广泛分布于中枢神经系统,他的过度激活可以提高神经元兴奋性,在癫痫的发病中起着重要作用(Yue Hu et al.,2012)。我们推测NPY是否有可能通过调节AMPA受体的功能,抑制癫痫发作的作用?本实验选用大鼠海马神经元癫痫样放电模型,采用膜片钳技术检测NPY对大鼠海马神经元癫痫样放电的影响,检测NPY对细胞癫痫样放电状态下的AMPA电流的影响,检测海马神经元癫痫样放电状态下的AMPA受体Glu2亚单位m RNA及总蛋白和蛋白磷酸化变化,以及NPY对其的影响,并检测NPY对海马神经元癫痫样放电后的相关凋亡指标的检测,最后通过动物实验验证NPY是否作用于海马神经元AMPA受体抑制动物癫痫发作,探讨NPY通过调节AMPA受体的生物活性、减弱兴奋性神经递质对神经元的损害和抗癫痫发作的机制,本实验共分四部分。第一部分神经肽Y对癫痫样放电状态海马神经元AMPA电流的影响目的:以原代培养的大鼠海马神经元为研究对象,用无镁(Mg2+free)细胞外液处理3h,然后用正常细胞外液继续培养,进而进行全细胞膜片钳实验,比较海马神经元癫痫样放电状态下神经肽Y对大鼠海马神经元AMPA电流的影响,探讨神经肽Y对AMPA受体功能的影响及其作用机理。方法:采用24h新生SD大鼠,取海马神经元原代培养,体外培养至第12d时,将海马神经元分为Control组、模型组(Mg2+free组),NPY(1μM)干预组,BIBP3226+NPY干预组。Control组换正常细胞外液处理3h,模型组只用无镁细胞外液处理3h,NPY组细胞是先以含NPY(浓度为1μmol/L)的细胞培养液孵育0.5h,然后用无镁细胞外液处理3h。BIBP3226+NPY干预组细胞先用含NPY Y1受体阻断剂BIBP3226(终浓度为1μmol/L)的细胞培养液孵育0.5h,再加入终浓度为1μmol/L的NPY孵育0.5h,最后加入无镁细胞外液处理3h。全细胞膜片钳技术检测Control组、模型组(Mg2+free组)和NPY(1μM)干预组的动作电位,全细胞膜片钳技术检测Control组、模型组(Mg2+free组)和NPY(1μM)干预组和BIBP3226+NPY干预组神经元的AMPA电流(IAMPA),计算峰值电流密度。结果:膜片钳实验显示模型组细胞出现稳定的异常动作电位,动作电位的频率和幅度明显高于Control组,NPY(1μM)干预组动作电位的频率和幅度都显著低于模型组(P<0.05)。模型组神经元IAMPA峰值密度较对照组显著降低(P<0.05),NPY(1μM)干预组IAMPA峰值电流密度较模型组显著升高(P<0.05),BIBP3226+NPY干预组的神经元IAMPA峰值电流密度较NPY干预组显著下降(P<0.05)。结论:模型组细胞在"无镁细胞外液”处理3h后,细胞出现异常动作电位,可以模拟细胞癫痫样放电,NPY预处理海马神经元可以抑制这种放电。海马神经元癫痫样放电可以出现神经元的IAMPA下降,NPY可以减轻癫痫样放电对神经元IAMPA的抑制,避免神经元IAMPA的过度下降,NPY有可能通过调节海马神经元的AMPA受体功能,发挥抗癫痫作用。提前加入NPY Y1受体阻断剂BIBP3226后,NPY的作用被抑制,提示NPY可能是通过激活Y1受体发挥对AMPA受体功能的调节。第二部分神经肽Y对海马神经元癫痫样放电状态AMPA受体Glu R2亚单位的影响目的:以原代培养的大鼠海马神经元细胞为研究对象,用无镁(Mg2+free)细胞外液处理3h制作海马神经元癫痫样放电模型,利用RT-PCR及Western blot法检测海马神经元癫痫样放电对AMPA受体Glu R2亚单位功能的影响,以及神经肽Y(NPY)对癫痫样放电海马神经元AMPA受体Glu R2功能的影响。方法:采用24h内新生SD大鼠,取海马神经元原代培养,体外培养至第12d时,随机分为Control组、模型组(Mg2+free组),NPY干预组和BIBP3226+NPY干预组,Control组换正常细胞外液处理3h,模型组只用无镁细胞外液处理3h,NPY组是先以含NPY的细胞培养液孵育0.5h,然后用无镁细胞外液处理3h,BIBP3226+NPY干预组先用含BIBP3226的细胞培养液孵育0.5h,再加入终浓度为1μmol/L的NPY孵育0.5h,最后加入无镁细胞外液处理3h,所有各组恢复正常细胞外液培养1h。用免疫荧光测定海马神经元Control组、模型组(Mg2+free组),NPY干预组的AMPA受体Glu R2亚单位表达。应用RT-PCR法及Western blot法检测Control组、模型组(Mg2+free组),NPY干预组和BIBP3226+NPY干预组中海马神经元的Glu R2m RNA表达水平及Glu R2亚单位的总蛋白和磷酸化变化。结果:免疫荧光染色显示Control组神经元外观正常,细胞轴突表达Glu R2明显,模型组神经元Glu R2荧光表达明显下降,NPY组神经元Glu R2的表达较模型组有所增强。RT-PCR检测显示模型组Glu R2m RNA较对照组显著下降(P<0.05),NPY干预组Glu R2m RNA较模型组显著上升(P<0.05),BIBP3226+NPY干预组Glu R2m RNA较NPY组显著下降(P<0.05)。Western blot实验显示模型组Glu R2亚单位的蛋白含量较对照组轻微下降,结果无统计学意义(P>0.05),模型组Glu R2亚单位的磷酸化水平较对照组显著升高(P<0.05),NPY(1μm)干预组Glu R2亚单位的磷酸化水平较模型组显著下降(P<0.05),BIBP3226+NPY干预组的Glu R2亚单位的磷酸化水平较NPY组显著升高(P<0.05)。结论:海马神经元在无镁细胞外液孵育3h后可以出现AMPA受体Glu R2亚单位蛋白磷酸化增加、而未出现细胞内总蛋白含量的明显变化,Glu R2 m RNA的复制受抑制,说明海马神经元癫痫样放电引起AMPA受体功能抑制的原因可能是由于Glu R2基因复制受抑制,蛋白出现磷酸化改变,以至神经元突触表面含正常Glu R2亚单位的AMPA受体减少、功能改变。神经肽Y可以抑制海马神经元癫痫样放电对AMPA受体Glu R2亚单位功能的过度抑制,这可能是其抑制癫痫的机制之一。应用神经肽Y的Y1受体阻断剂可以抑制神经肽Y这一作用,提示神经肽Y可能是通过与海马神经元上的Y1受体作用,来调节AMPA受体Glu R2功能。第三部分神经肽Y通过影响AMPA受体减轻海马神经元癫痫样放电后神经元凋亡目的:以原代培养的大鼠海马神经元细胞为研究对象,研究海马神经元癫痫样放电后是否会出现凋亡及神经肽Y是否可以通过影响海马神经元AMPA受体抑制凋亡的发生。方法:采用24h内新生SD大鼠,取海马神经元原代培养,体外培养至第12d时,将细胞随机分为Control组、模型组(Mg2+free组),NPY干预组和CNQX+NPY干预组,Control组换正常细胞外液处理3h,模型组只用无镁细胞外液处理3h,NPY组是先以含NPY的细胞培养液孵育0.5h,然后用无镁细胞外液处理3h,CNQX+NPY干预组预先用含CNQX的细胞培养液孵育0.5h,再加入终浓度为1μmol/L的NPY孵育0.5h,最后加入无镁细胞外液处理3h。各组细胞恢复正常细胞培养液12小时,应用TUNEL法检测各组神经元细胞凋亡情况,应用Western blot法检测各组神经元细胞的Caspase-3蛋白的表达,应用RT-PCR法检测各组神经元细胞Caspase-3m RNA水平。结果:TUNEL法检测显示模型组较Control组海马神经元阳性神经元明显增加(P<0.05),NPY干预组阳性神经元明显低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测显示模型组Caspase-3的蛋白含量较对照组显著升高(P<0.05),RT-PCR法检测显示Caspase-3m RNA较对照组也显著升高(P<0.05),两者变化一致。NPY干预组Caspase-3的蛋白水平较模型组显著下降(P<0.05),Caspase-3m RNA较模型组显著下降(P<0.05)。CNQX+NPY干预组的Caspase-3蛋白水平较NPY组显著升高(P<0.05),Caspase-3m RNA较NPY组显著升高(P<0.05)。结论:海马神经元癫痫样放电后可以出现神经元凋亡,这与动物急性癫痫模型的表现是一致的。神经肽Y可以抑制这种癫痫样放电引起的神经元凋亡,对神经元有保护作用,应用AMPA受体阻断剂CNQX后,神经肽Y的这一作用被抑制,提示神经肽Y可能是通过影响海马神经元AMPA受体的功能来发挥抗凋亡保护神经元的作用。第四部分神经肽Y对大鼠急性癫痫发作后Glu R2亚单位的影响及行为学改变目的:以SD大鼠为研究对象,通过观察经过海马CA3区分别注射神经肽Y和BIBP3226+神经肽Y后,侧脑室注射海人酸诱发大鼠急性癫痫发作,研究大鼠的行为学变化及海马CA3区的Glu R2亚单位功能变化,探讨神经肽Y以海马神经元AMPA受体Glu R2亚单位为靶点对大鼠癫痫发作的影响。方法:将SD大鼠分为Control组、模型组(海人酸致痫组)、NPY干预组、BIBP3226+NPY干预组,每组10只。各组动物采用立体定向微量注射相应药物,观察各组大鼠的行为学表现。根据Racine的分级标准对大鼠癫痫发作程度进行评估,以Ⅰ-Ⅱ级为轻度发作,Ⅲ级以上为重度发作。脑室注射后12小时,每组取5只大鼠用Western blot法检测各组动物海马CA3区的Glu R2亚单位的总蛋白变化和磷酸化变化,RT-PCR方法检测各组动物海马CA3区的Glu R2m RNA表达水平。结果:20分钟内,模型组大鼠出现癫痫重度发作,NPY干预组出现轻度发作,BIBP3226+NPY干预组的癫痫发作水平较NPY组显著升高(P<0.05),Control组未见癫痫发作。脑室注射后12小时,模型组Glu R2亚单位的蛋白含量与对照组性比无统计学变化(P>0.05),Glu R2亚单位的磷酸化水平较对照组显著升高(P<0.05),Glu R2m RNA较对照组显著下降(P<0.05)。NPY干预组Glu R2亚单位的磷酸化水平较模型组显著下降(P<0.05),Glu R2m RNA较模型组显著上升(P<0.05)。BIBP3226+NPY干预组的Glu R2亚单位的磷酸化水平较NPY组显著升高(P<0.05),Glu R2m RNA较NPY组显著下降(P<0.05)。结论:脑室内注射海人酸可以诱发癫痫发作,可以引起海马AMPA受体Glu R2亚单位表达受抑制,NPY可以抑制癫痫发作,其机制可能是通过激活海马神经元Y1受体而抑制Glu R2亚单位功能下调,来抑制大鼠癫痫的发生,更进一步证明我们的细胞实验。