一.miR-483-3p在胰腺导管腺癌中的表达及功能的初步研究[背景]MicroRNA (miRNA)是一类内源性非编码小RNA,通过转录后翻译抑制或靶mRNA裂解参与细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程。人类基因组中已鉴定出超过1000个miRNA,均为组织特异性表达。差异表达的miRNA可起到癌基因或抑癌基因的作用。研究发现,miR-483-3p与多种人类肿瘤的形成关系极为密切,且miR-483-3p在不同肿瘤中的表达也存在组织特异性,在有些肿瘤中表达异常升高,而在有些肿瘤中异常低表达,在不同肿瘤中所起的作用也不完全相同,甚至作用相反。如在胃癌等高表达的癌中发挥癌基因的作用,而在非小细胞肺癌中发挥抑癌基因的作用等。本研究的目的是阐明miR-483-3p在侵袭性的胰腺导管腺癌及非侵袭性的癌前病变的表达情况及其与临床病理特征和预后的关系,并进一步探索其在胰腺导管腺癌发生发展中所起的作用。[方法]1.利用锁定核酸-原位杂交技术(LNA-ISH)在组织芯片(63例胰腺导管腺癌和10例正常胰腺组织)中检测miR-483-3p的表达和定位情况。2.在另外117例胰腺导管腺癌患者[男性65例(58.8%),女性51例(41.2%)；年龄<65岁77例(65.8%),≥65岁40例(34.2%)]手术切除的石蜡组织包埋切片中(每例对应胰腺癌旁非肿瘤组织)验证miR-483-3p的表达情况,并分析miR-483-3p表达与胰腺导管腺癌临床病理特征的关系。并且对117例胰腺癌患者进行随访,对其中94例获得完整随访资料患者进行生存分析。采用log-rank法对miR-483-3p高表达组和低表达组做K-M曲线,比较二者总体生存时间差异。并分别用单因素和多因素Cox风险比例回归模型对各临床病理因素和miR-483-3p表达进行生存分析。3.进一步探索miR-483-3p在胰腺非侵袭性病变,如胰腺上皮内瘤变(PanlNs)中的表达情况。观察117例胰腺癌患者癌旁的39例PanlNl,27例PanIN2和16例PanIN3,并另外选取了11例慢性胰腺炎(CPs)组织标本,对其进行miR-483-3p表达情况检测,明确其是否是胰腺癌发生的早期事件。4.为进一步探究miR-483-3p在胰腺导管腺癌发生中所起的作用,我们选取了PANC-1和MIA PaCa-2两株高表达miR-483-3p的胰腺癌细胞系,转染miR-483-3p inhibitor,分别用CCK-8检测,Edu检测,和软琼脂克隆形成实验,PI单染,PI/FITC双染实验观察抑制miR-483-3p表达后对胰腺癌细胞生长,增殖,集落形成能力,及对周期和凋亡的影响,并在裸鼠体内进行皮下MIA PaCa-2细胞移植瘤种植,注射miR-483-3p antagomir,观察对体内肿瘤生长的影响。[结果]1.组织芯片检测结果显示miR-483-3p在61例(96.8%)胰腺导管腺癌组织中阳性表达,在正常胰腺组织的腺泡组织中阳性表达,但在正常的胰腺导管组织中阴性表达。2.进一步在另外117例胰腺导管腺癌中的验证检测发现,117例胰腺癌组织中,100%呈miR-483-3p阳性表达,其中强阳性表达的有65例(55.6%)。正常胰腺腺泡中全部呈强阳性表达,但在正常的胰腺导管组织中仅有13.7%(16/117)呈弱阳性表达,其余全部阴性。分析miR-483-3p与胰腺导管腺癌临床病理特征的关系,发现miR-483-3p表达与肿瘤的组织学分化级别相关(p<0.05)。高分化癌中miR-483-3p强阳性表达率为81.3%(26/32),中分化癌中为75.5%(37/49),低分化癌中为33.3%(12/36).MiR-483-3p表达与肿瘤分化级别呈负相关关系。对miR-483-3p表达与预后的关系进行log-rank分析,作Kaplan-Meier曲线,可以看到miR-483-3p高表达组比miR-483-3p低表达组的生存时间明显要短,miR-483-3p高表达组的中位生存期为22.0±4.2月,而miR-483-3p低表达组的中位生存期为34.0±9.3月(p=0.040)。用单因素Cox回归模型对各临床病理特征及miR-483-3p表达作预后分析,发现miR-483-3p高表达与较差的预后相关(HR=1.807；95%CI=1.012-3.227；p=0.045)。多因素Cox风险比例回归模型分析发现,miR-483-3p高表达是提示患者预后较差的独立预后因素(HR=2.584;95%CI=1.268-5.264；p=0.009)。3.胰腺上皮内瘤变(PanIN)是胰腺导管腺癌(PDAC)最常见的非侵袭性前体病变。在PanIN中检测miR-483-3p的表达情况,39例PanIN-1,19例(48.7%)弱阳性(+),20例(51.3%)阴性(一)；27例PanIN-2中,4例(14.8%)强阳性(2+),23例(85.2%)弱阳性(+)；16例PanIN-3中,14例(87.5%)强阳性(2+),2例(12.5%)弱阳性(+)。从PanIN-1到PanIN-3,miR-483-3p强阳性率分别为0/39(0%),4/27(14.8%)和14／16(87.5%)。可见,从PanIN-1到PanIN-3,miR-483-3p的表达量是随组织分化级别的升高而升高的(p<0.001)。在11例慢性胰腺炎中,仅有6例(54.5%)弱阳性表达miR-483-3p,其余全部阴性,未发现强阳性表达病例。综合以上结果表明,MiR-483-3p表达异常发生在胰腺导管腺癌发生发展的早期阶段。4.体外抑制miR-483-3p的表达能影响胰腺癌细胞的生长,增殖,周期,凋亡。体内瘤内多点注射miR-483-3p antagomir裸鼠移植瘤模型结果发现,注射miR-483-3p antagomir后肿瘤的生长速度显著降低,与注射control antagomir的对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.05)。[结论]miR-483-3p异常表达发生在胰腺导管腺癌的早期阶段；在胰腺导管腺癌中miR-483-3p的表达与组织学分化相关,并且其高表达提示较差的预后；体外和体内抑制miR-483-3p的表达能抑制胰腺癌细胞的生长,因此miR-483-3p可能成为胰腺导管腺癌潜在的治疗靶点。二.miR-483-3p对肾上腺皮质肿瘤诊断和预后的意义研究[背景]肾上腺皮质癌和腺瘤的治疗和预后有极大差别,但是二者的鉴别诊断却很困难。本研究的目的是寻找鉴别肾上腺皮质癌(ACC)和腺瘤(ACA)相关的临床病理指标和分子标志物。[方法]样本来源于2001年7月至2012年7月北京协和医院经手术切除的肾上腺肿瘤标本。其中具有完整的临床、病理资料的肾上腺皮质癌存档石蜡标本共25例作为实验组；肾上腺皮质腺瘤1564例,从中随机选取25例作为对照组。对这50例肾上腺皮质肿瘤的临床资料进行回顾性分析,采用WEISS系统进行组织形态学评分,并进行随访。用锁定核酸原位杂交技术(LAN-ISH)检测miR-483-3p的表达,用免疫组化的方法(IHC)检测IGF2和Smad4的表达情况,并分别分析miR-483-3p表达与IGF2或Smad4表达之间的关系。分别分析这三个指标与临床病理特征的关系。进一步检测细胞增殖指数MIB-1在肾上腺皮质癌和腺瘤中的表达情况,并分析上面三个指标与细胞增殖指数MIB-1之间的联系。在选取的15例交界性肿瘤(WEISS得分=2或3)中检测这四个指标的表达情况,并进行随访,根据随访结果检测各指标的诊断效能。[结果]临床资料回顾性分析和WEISS系统评估结果发现：肿瘤的大小,重量,内分泌功能和Weiss系统都是鉴别良恶性肾上腺皮质肿瘤的有效指标(p<0.001)。MiR-483-3p在68%(17/25)肾上腺皮质癌(ACC)中过表达,而仅在12%(3/25)肾上腺皮质腺瘤(ACA)中过表达(p<0.05)。而且,通过分析miR-483-3p表达与IGF2和Smad4蛋白表达的关系,发现miR-483-3p表达与IGF2蛋白表达正相关(p<0.05),但与Smad4蛋白表达无统计学联系(p>0.05)。联合应用miR-483-3p和Smad4蛋白表达两个指标可提高肾上腺皮质癌的诊断准确性。而且,Smad4蛋白过表达是提示好的疾病结果的预后指标。MIB-1在64%(16/25)ACCs中高表达,仅在4%(l/25)ACAs中高表达。然而,MIB-1表达与miR-483-3p, IGF2或Smad4表达无统计学相关性。通过进一步在15例交界性肿瘤中检测这四个指标,确认了联合应用miR-483-3p和Smad4蛋白表达这两个指标可以辅助WEISS评分更好的从组织学较难判定的交界性肿瘤中鉴别出肾上腺皮质癌。[结论]肿瘤大小,重量,内分泌功能和Weiss系统是准确鉴别诊断大多数肾上腺皮质癌与腺瘤的临床病理指标。而在组织学上较难鉴别的交界性肿瘤,miR-483-3p和Smad4的联合应用可用来辅助鉴别诊断肾上腺皮质癌。