纳豆激酶的制备及其药效学研究

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纳豆激酶(Nattokinase,NK)是在纳豆的发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种碱性丝氨酸蛋白酶。研究表明,纳豆激酶具有强烈溶解血栓的能力,与临床所用的尿激酶、链激酶及组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等药物相比,纳豆激酶具有安全性好,半衰期长,口服有效及生产成本低等优点。因此纳豆激酶作为新型抗血栓及溶血栓药物具有广阔的市场前景和巨大的产业化潜力。本文通过简化纳豆激酶的制备工艺制备高纯度的纳豆激酶,评价其体内体外的抗血栓和溶血栓作用,为纳豆激酶药品的开发和应用提供理论依据。对实验室分离到的高产纳豆菌株(Bacillus subtilis natto LNUB236)进行发酵培养,在硫酸铵饱和度为65%时将纳豆激酶从发酵液上清中分离出来,离心后所得的沉淀用pH7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶解即得纳豆激酶粗酶液,粗酶液离心除去不溶性杂质后通过5 cm×140 cm Sephadex G-75凝胶柱进行两次柱色谱,所收集到的洗脱液用超滤管离心浓缩后,合并柱内溶液并进行冷冻干燥即得高纯度的纳豆激酶冻干粉。纤维蛋白-琼脂糖平板检测结果显示纯化后纳豆激酶的量为96000 IU,SDS-PAGE检测结果为一条清晰的条带,相对分子量约为28 Kd,纯化倍数为34.7,纯度达90.6%,回收率为76.94%。纳豆激酶溶血栓及抗血栓作用的评价是通过测定体外溶栓作用,SD大鼠体内构建血栓模型并检测纳豆激酶引起血液中重要纤溶指标的变化等方面展开的。在体外药效学研究中,对血凝块的溶解作用结果显示,生理盐水组血凝块的溶解率为9.45%,酶用量为100、200及300 IU时,尿激酶组血凝块的溶解率分别为23.11%,22.47%和23.15%,纳豆激酶组溶解率分别为42.58%,51.87%和83.12%,血凝块的溶解率随纳豆激酶用量的增加而升高,且显微镜下观察从血凝块中释放出的各组红细胞结果显示各组细胞膜均保持完整状态,表明100~300 IU的纳豆激酶对红细胞没有破坏作用;在溶血试验中,红细胞的溶血率随着纳豆激酶浓度的增大而升高,纳豆激酶的浓度为80~240 IU/mL时,红细胞的溶血率均小于5%,浓度为280 IU/mL时,红细胞的溶血率为5.51%,提示为了避免产生溶血现象,临床使用纳豆激酶时其血药浓度应当控制在280 IU/mL以下。体内药效学研究中,以SD大鼠为研究对象,与空白对照组相比,纳豆激酶通过灌胃给药12天后,由角叉菜胶所致SD大鼠尾部血栓的长度随纳豆激酶给药剂量的增大而延长,但所形成的血栓长度均小于生理盐水组。在5000 IU/kg、10000IU/kg及15000 IU/kg三个给药剂量中,与空白对照组相比,5000 IU/kg的纳豆激酶能显著减轻由角叉菜胶所致SD大鼠尾部血栓的形成(P<0.0001),显著增加SD大鼠血浆中FDP(P<0.01)及D-Dimer的含量(P<0.0001);以SD大鼠为研究对象,在腹腔注射给药组中,与空白对照组相比,5000 IU/kg纳豆激酶能显著减轻由角叉菜胶所致SD大鼠尾部血栓的形成(P<0.0001),同时显著增加 SD 大鼠血浆中 FDP(P<0.01)及 D-Dimer 的含量(P<0.0001),与 15000 IU/kg阳性对照药尿激酶相比,5000 IU/kg的纳豆激酶显著减轻由角叉菜胶所致SD大鼠尾部血栓的形成(P<0.01),同时显著增加SD大鼠血浆中D-Dimer的含量(P<0.01)。由此可见口服及注射低剂量的纳豆激酶均具有良好的抗血栓作用。
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