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植物的大多数抗性基因编码CC/TIR-NB-LRR蛋白,其中C端为LRR结构域,N端为CC结构域,中间连接着NB-ARC结构域。LRR结构域的主要功能是识别效应分子,与NB-ARC结构域相互作用以改变核苷酸绑定区域的位置和构象,从而产生免疫反应最原始的信号,再通过CC结构域的相互作用介导下游的免疫反应[43]。某些植物的抗性基因,仅单独的N端CC结构域便能产生免疫自激活,触发细胞程序性死亡反应,例如大麦的白粉病抗性基因MLA10。因此,CC结构域的这种免疫自激活反应为广谱抗性基因的设计与利用提供了新的思路。本实验室前期研究发现Pi36基因单独的CC结构域出现自激活现象,能明显触发细胞死亡反应[43];且水稻抗性基因Pi36的CC结构域是一个独立的功能单位,其转基因水稻能够通过介导抗性反应,使相关抗性基因的表达量升高,增强水稻稻瘟病的抗性反应,从而使水稻抗性程度增强。本研究以此为基础,用Pi36CC的结构域构建载体,利用酵母双杂交系统筛选出一个与Pi36CC互作的互作蛋白36IP4。验证该互作蛋白与Pi36CC互作的真实性,并对该蛋白基因的功能进行了初步研究。主要研究结果如下:1、筛选出一个与Pi36CC互作的互作蛋白36IP4。通过酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）,筛选出一个与Pi36CC互作的蛋白36IP4。其编码基因位于第6号染色体上,是由长度为1356bp的编码区和2个内含子组成,基因全长为2360bp,编码序列（coding sequence,CDS）长度为1356bp,该基因为在水稻中为表达蛋白,基因序列内含有一个TPR-11 Superfamily结构域。2、候选互作基因36IP4在Kasalath的非亲和菌株Guy11侵染过程中不同时间段的表达量变化趋势与Pi36一致。首先,我们选取6个稻瘟病菌（FJ10-1、Guy11、ZB15、ZB25、ZB13、Zhong1）,培养孢子进行菌株滴菌侵染实验,筛选得到对Kasalath植株非亲和的菌株和亲和的菌株分别为Guy11和ZB15;其次,用非亲和菌株Guy11及亲和菌株ZB15的侵染kasalath过程中,取滴菌侵染各时间段的叶片样品提取叶片RNA并反转录后做定量PCR,观察0h、12h、24h、48h的侵染过程中36IP4的表达量变化,结果表明基因36IP4在各个时间段内均有一定量的表达,但在非亲和菌株Guy11的侵染过程中该基因的表达量明显高于亲和菌株ZB15的侵染过程,推测该基因可能受到了非亲和菌株Guy11的诱导,参与了Kasalath的抗病免疫过程;将非亲和菌株Guy11侵染kasalath,在不同的时间段内测定抗病基因Pi36的表达量变化,其变化的规律也是同基因36IP4的趋势一致。由于36IP4与Pi36CC存在相互作用,在kasalath抗病过程中表达量明显提高,且与Pi36的表达量变化趋势一致。推测36IP4可能在稻瘟病非亲和菌株侵染水稻kasalath过程中,与Pi36具有协同关系。3、酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）和双分子荧光互补技术（Bimolecular fluorescence complementation,BiFC）互作验证表明36IP4与Pi36CC之间存在真实互作。对Pi36CC和36IP4进行酵母双杂交互作验证,构建Pi36CC-AD、Pi36CC-BK、36IP4-AD、36IP4-BK载体,Pi36CC和36IP4选择双酶切法,酶切位点为EcoR1和BamH1,该方法证实了Pi36CC和36IP4在酵母中能直接发生相互作用;对Pi36CC和36IP4通过双分子荧光互补实验进行互作验证,构建载体pXY104-cYFP-Pi36CC、pXY106-cYFP-Pi36CC、pXY104-cYFP-36IP4、pXY106-cYFP-36IP4,选择双酶切位点BamH1和Xba1,将其转入农杆菌并摇菌注射幼嫩烟草叶片观察荧光反应,结果表明Pi36CC和36IP4在烟草叶片的细胞膜和细胞核上有直接作用,再次验证Pi36CC和36IP4的互作是真实性的。4、候选互作基因36IP4被定位于细胞核和细胞质内。36IP4基因的氨基酸序列在亚细胞定位预测网站（https://www.genscript.com/tools/wolf-psort）预测定位,其预测结果为该基因在细胞核和胞质内;随后,我们构建亚细胞定位载体36IP4+PHB-YFP,将其转入农杆菌中,打入烟草叶片内观察其荧光,在共聚焦显微镜下观察其荧光反应发生在细胞核和胞质内,与预测结果一致,判断其基因定位在细胞核和胞质。5、稻瘟病接种实验结果表明,36IP4可能抑制水稻抗稻瘟病过程。将36IP4基因在TP309和Kasalath中进行基因敲除和过表达。TP309的过表达和基因敲除植株均获得15株,将过表达植株进行抗潮霉素阳性鉴定得出10株阳性植株;将敲除植株提取叶片DNA进行测序分析,结果得到11株敲除阳性植株,其中3株为纯合突变,8株为杂合突变。Kasalath的过表达和基因敲除分别获得21株和17株;将TP309的过表达和基因敲除阳性叶片进行非亲和菌株Guy11滴菌实验（TP309为对照组）,观察基因敲除和过表达叶片的感病情况,并通过image J软件统计病斑相对面积。实验结果表明,与对照组TP309-Guy11菌斑对比,转基因过表达T0植株的侵染菌斑面积大于对照组的菌斑面积;而转基因敲除T0植株菌斑面积小于对照组的菌斑面积。该结果表明,36IP4基因的过量表达相对于对照增强了感病程度,而敲除该基因则感病程度减弱,推测可能抑制了水稻对稻瘟病的响应。