背根神经节神经元细胞N-型钙通道对外周神经痛的信号传递具有重要的调控作用,已经用于临床实验的N型钙通道阻断剂既可以作用于疼痛传导通路,同时也对中枢及自主神经系统产生影响。研究发现N-型钙通道CaV2.2e37a亚型特异地表达于DRG神经元。本课题组在前期的研究中已经设计筛选出针对CaV2.2e37a有特异性抑制作用的siRNA,并在293T细胞上验证了该siRNA可以特异性地抑制与其共转染的CaV2.2e37a全长基因的表达。本研究拟用慢病毒载体携带该siRNA转染原代背根神经节神经元细胞,并观察神经元细胞转染效率及转染后细胞的电生理学变化,为进一步研发以CaV2.2e37a为靶点的镇痛药物提供实验依据。第一部分LV-shCaV2.2e37a转染原代背根神经节神经元细胞的观察目的：培养出状态良好,适合膜片钳研究的原代背根神经节神经元细胞,检测LV-shCaV2.2e37a对原代背根神经节神经元细胞的转染效果。方法：原代背根神经节神经元细胞的培养：将新生24小时后的SD大鼠用剪刀断头后,在显微镜下用显微剪沿椎管腹侧前正中线切开脊柱,在脊柱两侧椎间孔可见背根神经节,用手外科显微镊取出背根神经节。清除多余的神经及被膜,将组织切成直径0.2-0.3mm,平铺于加入NB培养液的小号培养皿中。分别于24h、48h,在相差显微镜下记录DRG细胞形态变化。原代背根神经节神经元细胞培养成功后对细胞进行免疫荧光染色,明确细胞来源,膜片钳检测原代背根神经节神经元细胞的电生理状态。使用LV-shCaV2.2e37a转染原代背根神经节神经元细胞并观察其转染效率。结果：培养的背根神经节神经元细胞,免疫染色显影,细胞钠电流可引出。荧光显微镜下观察到：LV-shCaV2.2e37a转染后,原代背根神经节神经元细胞发绿色荧光,转染率(40.09±2.81)%。结论：不使用消化酶,单纯借助显微手术器械及解剖显微镜分离背根神经节神经元细胞并进行培养,可培养出状态良好,适合电生理研究及细胞转染研究的DRG神经元细胞,LV-shCaV2.2e37a可以转染DRG神经元细胞。第二部分鞘内注射LV-shCaV2.2e37a对CCI大鼠镇痛效应及其对背根神经节神经元细胞电生理影响的初步观察目的：研究鞘内注射LV-shCaV2.2e37a对CCI模型大鼠镇痛效应、DRG神经元转染效率以及转染后DRG神经元的电生理的变化。方法：健康雄性SD大鼠12只,随机分为2组,CCI组及对照组。制作CCI模型,通过观察感觉异常和痛觉过敏阈值的变化与对照组进行统计学分析。造模成功后,将CCI组随机分为两组,siRNA治疗组,阴性对照组。siRNA治疗组于制作CCI模型第19天后,鞘内注射LV-shCaV2.2e37a 10μl(1×109TU/mL)；阴性对照组于制作CCI模型后第19天鞘内注射空慢病毒颗粒10μl(1×109 TU/mL).鞘内注射第3天、第7天检测各组CCI大鼠的机械性缩足反射阈值(MWT)和C02激光热缩足阈值(TWT)。鞘内注射7天后,急性分离大鼠背根神经节细胞,观察到LV-shCaV2.2e37a在DRG神经元细胞的转染率为3%。运用膜片钳技术观察分离的大鼠背根神经节神经元细胞的电流变化。结果：术后第9天MWT及TWT达到高峰(P＜0.01)。鞘内注射1w,siRNA治疗组大鼠MWT及TWT较同—时间阴性对照组提高(P＜0.05)。siRNA治疗组DRG神经元细胞可观察到外向电流。结论：鞘内注射LV-shCaV2.2e37a可转染至背根神经节神经元细胞,并且可使CCI大鼠机械性触诱发痛缩足反射阈值(MWT)和CO2激光热缩足反射阈值(TWT)均增高(P<0.05). siRNA治疗组DRG神经元细胞可引出外向电流的性质有待进一步研究。