论文部分内容阅读
目的通过M2型肿瘤相关巨噬细胞(M2-tumor-associated macrophages,M2-TAMs)分泌细胞因子白细胞介素17(Interleukin 17,IL-17)激活肝癌细胞JAK2/STAT3信号通路进而抑制肝癌细胞凋亡的机制研究,以期为临床肝癌的诊治奠定基础。方法选取7例经病理学确诊的临床肝癌组织以及5例正常的肝脏组织(源于急性胆管结石患者行半肝叶切除术留取),通过免疫组化法和免疫荧光法检测M2-TAMs在肝癌组织中的浸润情况;体外培养人源单核细胞(THP1),经PMA(佛波酯,100ng/ml)和IL-4(白介素4,100ng/ml)作用后分化诱导为M2-TAMs;通过ELISA及Western Blot检测M2-TAMs不同时间内(0h、6h、12h、24h)IL-17的表达情况;体外培养肝癌细胞(SMMC7721,HepG2细胞),利用Transwell小室(膜直径24μm,膜孔径0.4μm),将M2-TAMs与肝癌细胞共培养24h后,收集细胞,提取蛋白,Western Blot检测肝癌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3的表达情况以及JAK2/STAT3信号通路的活化情况;通过siRNA干扰M2-TAMs中IL-17的表达,与肝癌细胞Transwell共培养24h后,收集细胞,提取蛋白,Western Blot检测肝癌细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Cleaved Caspase-3的表达情况以及信号通路JAK2/STAT3的活化情况;AG490特异性阻断肝癌细胞JAK2/STAT3信号通路后,与M2-TAMs共培养24h,收集细胞,提取蛋白,Western Blot检测肝癌细胞的凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3的表达情况。采用SPSS17.0软件进行统计学处理,两组比较采用t检验进行统计分析,多组比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1免疫组化及免疫荧光法检测显示CD68、CD163和CD206阳性的M2-TAMs在肝癌组织内大量表达。2经Real-time PCR检测THP1细胞成功分化为M2-TAMs后,继续培养24h,收集不同时间内的培养上清液,ELISA检测发现随时间的递增IL-17分泌量也逐渐增加,12~24h达到高峰;收集不同时间内的细胞,提取蛋白,Western Blot检测显示随时间的延长IL-17的表达逐渐升高,12~24h达到高峰。3 M2-TAMs与肝癌细胞共培养24h后,收集细胞,提取蛋白,Western Blot检测显示抗凋亡相关蛋白Bcl-2在与M2-TAMs共培养的肝癌细胞中表达明显升高,凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3、Bax表达显著降低,同时Western Blot检测显示JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白的表达显著增加。4 siRNA干扰M2-TAMs中IL-17基因后,与肝癌细胞Transwell共培养24h,收集细胞,提取蛋白,Western Blot检测显示Bcl-2表达明显降低,Cleaved caspase-3表达显著升高,同时Western Blot检测显示JAK2、STAT3及p-STAT3蛋白的表达降低。5 AG490阻断JAK2/STAT3通路后,与M2-TAMs共培养24h,收集细胞,提取蛋白,Western Blot检测发现,抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达显著降低,凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3表达明显升高。结论肝癌组织中大量浸润M2-TAMs,并通过分泌IL-17激活肝癌细胞JAK2/STAT3信号通路,进而抑制肝癌细胞凋亡相关蛋白的表达。