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沙田柚属芸香科柑橘属果树,为配子体高度自交不亲和植物,其自交不亲和的分子机理目前尚未见报道。miRNA是一类序列长度为20-24nt的非蛋白质编码的内源小分子RNA,在植物的生长发育和逆境胁迫反应等过程起着重要作用。因此,寻找与沙田柚自交不亲和相关的miRNA,阐述由miRNA介导的自交不亲和反应的分子机制尤为重要。本研究以沙田柚未授粉花柱（SC）、自交1、2、3天（ZJ1、ZJ2、ZJ3）以及异交1、2、3天花柱（YJ1、YJ2、YJ3）为实验材料,构建小RNA测序文库。利用HiSeq深度测序对所有的Small RNA进行测序。然后对差异表达miRNA进行分类注释和靶基因预测,并对靶基因进行GO功能注释以及KEGG pathway注释,探讨miRNA在沙田柚自交不亲和中的作用。主要结果如下:1、采用高通量测序技术对沙田柚7个样品的小RNA文库进行测序,各个样品获得的total-reads分别为:SC为 13326242、YJ1 为23674636、YJ2为 14465682、YJ3 为24805180、ZJ1为21113205、ZJ2为19050972、ZJ3为22881662。去除低质量序列、接头序列、小于18nt的序列后,获得的clean-reads分别为:SC为11523295、YJ1为23046850、YJ2 为 12556786、YJ3 为 23949192、ZJ1 为 20472150、ZJ2 为 18567950、ZJ3 为 22197840。将获得的clean-reads比对到基因组,各样品比对到基因组的sRNA的数目分别为:SC为 7284921、YJ1 为 16759796、YJ2 为 8594610、YJ3 为 17855172、ZJ1 为 15341949、ZJ2 为 13545677、ZJ3 为 16132232。2、基于miRNA相似性序列和二级结构预测的结果表明:7个样品中鉴定出已知的miRNA属于28个家族,包括一个未定义家族。7个样品中,未授粉花柱中已知miRNA的个数为118,新miRNA为411个。异交1、2、3天花柱中的已知miRNA的个数分别为232、122和219个,新miRNA分别为1184、476和836个。自交1、2、3花柱中已知miRNA的个数分别为178、179和186个,而新miRNA则分别为640、739和801个。各样品中新miRNA数量要大于已知的miRNA数量。3、异交/自交差异表达的miRNA中,miR390a-5p调控有刺激花粉管生长作用的生长素应答反应,可能在花粉管生长中发挥作用;miR172a-5p靶向泛素化途径中的SCF复合体,该靶基因参与的泛素蛋白酶体途径通过与miR5059靶向的AUX/IAA与植物激素信号传导途径相联系,且两个miRNA表达模式基本一致,说明其可能通过调控两条代谢途径参与自交不亲和。在自交和异交样品中持续上调或下调的miRNA中,miR171f在异交样品中持续下调,而miR393-3p在异交样品中持续上调,这两个miRNA主要参与植物的胁迫应答反应,已经证明授粉与压力胁迫应答显示有重叠。miR6197-5p、miR414靶基因功能注释为在花粉管生长过程发挥作用的WRKY转录因子,并在YJ/ZJ中差异表达;说明以上的miRNA可能在自交不亲和反应中发挥一定作用。4、novelmir691和novelmir1021靶向生长素转录因子;novel-mir17靶基因注释到cullin-like protein;靶基因注释为14-3-3 protein（参与多种植物激素信号通路）的novelmir2854和novelmir1770靶向细胞膜成分的磷脂酰肌醇,在YJ/ZJ中存在差异表达,说明可能参与到了自交不亲和反应中去。5、在自交花柱中特有并差异表达的miRNA:novelmir2344靶基因功能为果胶酯酶抑制剂,miR9470-3p靶基因功能有γ-氨基丁酸（GABA）受体和参与糖酵解途径,miR9560a-5p靶基因功能为壁相关受体激酶,miR395靶基因功能为半乳糖代谢和在壁的合成中也发挥一定作用,miR2118b靶基因功能为热激蛋白和分子伴侣功能,miR8775 基因功能包括有泛素调节蛋白酶体途径;miR9560a-5p与novelmir651持续在自交三天持续上调,分别靶向壁受体相关蛋白激酶和植物激素信号传导过程受体蛋白,这些miRNA在自交不亲和中可能发挥负调控作用。novelmir 2651的靶基因为影响花粉管生长的肌动蛋白结合蛋白和类黄酮,此外还有影响孢粉素（花粉壁组成成分）的细胞色素P450,但关于其调控模式和在沙田柚自交不亲和中的作用需进一步验证。6、采用实时荧光定量PCR验证了14个差异表达的miRNAs,结果表明miRNAs的表达结果与测序数据基本一致。