论文部分内容阅读
与传统化学药物相比,蛋白质和多肽药物具有更高的安全性和靶点特异性,但其开发应用仍然存在众多挑战,其中最重要原因之一就是蛋白质和多肽药物的体内半衰期普遍偏短。为了克服上述问题,研究人员逐渐发展出多种蛋白长效化技术,通过改变药物分子的结构来影响其体内代谢速率及方式,进而延长蛋白质和多肽类药物的半衰期。相比糖基化修饰,融合蛋白修饰或PEG修饰,脂肪酸修饰不仅能实现半衰期的延长,还有助于提高药物的脂溶性、肠道黏膜透过及吸收效率,故而越来越受到研究人员的关注。传统的蛋白药物脂肪酸修饰主要通过体外化学偶联的方式来实现,存在反应条件限制多、修饰效率偏低、分离步骤复杂、修饰均一度差等多种局限。合成编码技术利用正交氨酰tRNA合成酶可以在表达宿主体内将修饰后的氨基酸(非天然氨基酸)点特异的引入到蛋白的特定位点,生产修饰蛋白,从而从原理上避开蛋白体外修饰的各种限制。本论文中,我们设计了一种带7个碳原子脂肪酸链的非天然氨基酸-HepoK,通过高通量筛选获得了一个对HepoK特异的正交氨酰tRNA合成酶;然后利用合成编码非天然氨基酸技术,在E.coli体内分别将HepoK引入到到肌红蛋白(Myoglobin)、胰高血糖素样肽1(GLP-1,即本文中LIT)及成纤维细胞生长因子21(FGF21))的特异位点,柱层析分离得到均一脂肪酸修饰的蛋白质;质谱分析带HepoK的肌红蛋白,确证了HepoK插入的特异性,并比较了插入HepoK前后,成纤维细胞生长因子21及胰高血糖素样肽1与人血浆白蛋白的相互作用,发现带有HepoK的蛋白与人血浆白蛋白间有着更强的相互作用力,且带HepoK的胰高血糖素样肽1与人血浆白蛋白的结合高于市售利拉鲁肽。证明通过合成编码非天然氨基酸技术生产的脂肪酸修饰蛋白可特异的与HSA的结合,从而延长其在体内的半衰期。总之,本研究利用合成编码技术在表达宿主体内直接实现蛋白质的脂肪酸修饰,并证明修饰后的蛋白质与人血浆白蛋白有特异结合,从而为长效化蛋白生产提供了更高效、更均一的方案。