牙周病涉及牙周膜、牙骨质、牙槽骨三种不同组织,组织学表现为炎症浸润下的牙周膜退缩、牙槽骨吸收以及牙骨质的暴露。牙周病牙周重建需要成骨细胞、成牙骨质细胞以及牙周成纤维细胞的共同参与,但是因长期炎症破坏,牙周病病病变区域的种子细胞数量有限,无法依靠自身种子细胞达到组织再生和功能重建,需要大量种子细胞移植至牙周病变区域,以满足牙周组织重建的要求。而在牙周重建过程中,成牙骨质细胞在牙周纤维的定植以及牙周膜的形成中起着重要作用,因此,选取可向成牙骨质细胞定向分化的种子细胞,是牙周重建的关键。作为一类具有多向分化潜能的干细胞,间充质干细胞在组织器官损伤修复以及再生治疗方面,表现出广阔的应用前景。目前,已经在许多成人组织中成功分离出了不同组织来源的间充质干细胞,并且成功应用于重建受损组织和细胞基因治疗。在多种间充质干细胞中,胎盘来源间充质干细胞来源更原始,多向分化能力更强；来源充足,无伦理问题；免疫原性低,可同种异体或异种移植；病毒感染率低,安全性高等方面的优点,具有更好的临床应用前景。而诱导间充质干细胞定向分化,需要建立合适的诱导微环境。在牙周组织发育过程中,釉基质蛋白衍生物起着不可或缺的作用。研究发现釉原蛋白是釉基质蛋白最主要的活性成分,在牙周发育及改建过程中,具有促进牙骨质形成、牙周膜细胞增殖和骨诱导的能力,国内外研究显示其诱导干细胞向牙周表型分化效果可靠。因此,本实验通过构建釉原蛋白腺病毒载体建立体外诱导微环境,诱导胎盘来源间充质干细胞向成牙骨质细胞分化,同时研究诱导非牙源性干细胞获得的再生牙周细胞在正畸力作用下的反应机制,为采用牙周组织工程进行牙骨质重建提供新的种子细胞来源,并为再生牙周在正畸力下反应机制的研究提供参考依据。材料和方法1.釉原蛋白腺病毒过表达载体的构建采用人X染色体的釉原蛋白cDNA编码序列(GenBank Accession No.M86932)作为目的基因,在序列两端分别加上EcpR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点,全基因合成法合成。利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ,将釉原蛋白基因插入到腺病毒辅助载体,然后将釉原蛋白腺病毒辅助载体和腺病毒骨架载体共转染293细胞,采用细胞内同源重组方法,获得复制缺陷型釉原蛋白腺病毒过表达载体。2.胎盘来源间充质干细胞的分离及鉴定采用酶消化法消化人足月胎盘底蜕膜组织,通过密度梯度离心法获取胎盘来源间充质干细胞,倒置显微镜观察细胞生长特点及形态变化；根据活细胞线粒体内脱氢酶可还原CCK-8成有色的formazan的原理,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力；利用不同细胞对光线的特征性散射原理,采用流式细胞仪检测胎盘来源间充质干细胞的细胞周期及干细胞免疫表型(CD73、CD90、CD105、CD29、CD31、 CD34、 CD11b、CD19、CD45和HLA-DR);采用成骨诱导液及成脂诱导液诱导胎盘来源间充质干细胞向成骨细胞及脂肪细胞分化,证实盘来源间充质干细胞的多向分化能力。3.釉原蛋白腺病毒载体诱导胎盘来源间充质干细胞向成牙骨质细胞分化的体外实验将釉原蛋白腺病毒过表达载体转染胎盘来源间充质干细胞,诱导其向成牙骨质细胞分化。对转染后的胎盘来源间充质干细胞分别在细胞形态学、增殖活性、体外矿化能力及成牙骨质细胞相关基因表达变化进行诱导后的细胞表型鉴定。同时,通过沉默FAK基因,研究非牙源性干细胞获得的类成牙骨质细胞在正畸力作用下破骨相关信号因子M-CSF、RANKL及OPG的反应机制。结果1.采用细胞内同源重组法获得了高效过表达釉原蛋白的重组腺病毒Ad-AMG及对照腺病毒Ad-EGFP载体,Ad-EGFP证实腺病毒载体转染效率高。以病毒载体通用引物进行PCR鉴定,PCR产物测序证实腺病毒载体携带的釉原蛋白基因序列与Gen Bank人X染色体的釉原蛋白基因序列完全符合,同时提取了转染Ad-AMG后293细胞的总蛋白,经Western-Blot检测证实了釉原蛋白的表达。2.本实验培养的胎盘来源间充质于细胞生长状态良好,细胞呈现均一长梭形的成纤维细胞样,细胞呈平行或漩涡状排列生长。流式细胞仪检测细胞免疫表型证实细胞表达典型的间充质干细胞表面抗原标记,不表达内皮细胞及血细胞表面抗原标记。多向分化潜能的鉴定,成骨诱导培养3周以后,可见明显高亮的矿化结晶,茜素红染色表现为深红色的结节。成脂诱导培养培养2周以后,可见细胞胞浆内串珠状或筛孔状圆形空泡充满整个细胞,油红0染色表现为橘红色的圆泡。3.转染釉原蛋白腺病毒过表达载体后,在釉原蛋白的诱导下,胎盘来源间充质干细胞逐渐呈现典型的成牙骨质细胞形态,即由原来的长梭形向扁平状、类圆形、多边形或不规则形状,细胞表面有短钝突起；转染后细胞增殖活性明显降低,细胞蛋白合成功能增强；基因水平及蛋白水平检测到了矿化因子BSP、OPN. OCN的表达,对照组为阴性,证明在釉原蛋白的诱导下胎盘来源间充质干细胞具有了矿化能力,同时RT-PCR及免疫组化检测到了牙骨质特异性蛋白CAP的表达,证明胎盘来源间充质干细胞分化为类成牙骨质细胞。通过进一步研究类成牙骨质细胞在压应力作用下的反应机制发现,类成牙骨质细胞RANKL及M-CSF的mRNA表达水平与压应力作用的时间成正比,随着压力加载时间的延长,RANKL/OPG的比值增大,结合M-CSF表达增高,说明在压应力作用下,类成牙骨质细胞具备诱导破骨细胞形成及分化的功能。在沉默FAK基因后,类成牙骨质细胞RANKL及M-CSF的mRNA表达水平随压应力加载时间延长基本保持不变,但OPG的mRNA表达水平增高,RANKL/OPG的比值减小,通过干扰实验发现,FAK基因参与了类成牙骨质细胞诱导破骨细胞分化及成熟的过程。结论1.细胞内同源重组法成功构建了高效过表达釉原蛋白的重组腺病毒Ad-AMG及对照Ad-EGFP载体。Ad-AMG腺病毒载体转染效率高且能够正确地表达釉原蛋白。2.采用胶原酶Ⅱ消化组织并通过密度梯度分选法筛选出的胎盘来源间充质干细胞纯度较高,细胞为均一长梭形的成纤维细胞样,呈平行或漩涡状排列生长。流式细胞仪及诱导分化实验证实了其典型的间充质干细胞特性。经釉原蛋白诱导后,胎盘来源间充质干细胞在细胞形态学、细胞增殖活性、体外矿化能力以及成牙骨质细胞特征性相关基因表达上,均显示了一些成牙骨质细胞特性。证实胎盘来源间充质干细胞在合适的诱导环境下可以向成牙骨质细胞分化。3.诱导胎盘来源间充质干细胞获得的类成牙骨质细胞在压应力作用下具备了诱导破骨细胞发生、成熟的功能,证明了非牙源性干细胞诱导向牙周细胞分化后可以参与正畸治疗中牙周组织的改建。同时,与细胞骨架重组有关的FAK基因参与了破骨相关信号因子的表达。