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目的：
肾间质纤维化（renalinterstitialfibrosis,RIF）是各种慢性肾脏疾病（chronickidneydisease,CKD）进展为终末期肾功能衰竭的共同结果，其发生发展是由细胞因子的产生、正常固有细胞的表型转化、细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）的大量堆积等多种因素相互作用的结果。本实验选择与肾间质纤维化密切相关的促纤维化因子的释放、ECM的分泌及氧化应激等多方面为切入点，从整体、细胞两个层面验证蚓激酶对肾间质纤维化的保护作用可能是通过调节转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin,α-SMA）、I型胶原蛋白（typeⅠcollagen,Col-Ⅰ）、纤维连接蛋白（fibronectin,FN）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogenactivatorinhibitor-1,PAI-1）、黏着斑激酶（focaladhesionkinase，FAK）、Src以及激酶氧化酶4（NADPHoxidase4,NOX4），从而延缓肾间质纤维化的发展，为中医药防治肾脏纤维化提供科学依据。
方法：
1.健康的SD大鼠适应性饲养1周后随机分为6组，假手术对照组、UUO模型组、贝那普利组以及蚓激酶低、中、高剂量组，建立经典的大鼠单侧输尿管梗阻模型（unilateralureteralobstruction,UUO），使其逐渐发展成为肾间质纤维化。从造模后第2天开始对治疗组采用灌胃法进行药物干预，蚓激酶低、中、高剂量分别为0.9×105U?kg-1、1.8×105U?kg-1、3.6×105U?kg-1，贝那普利给药剂量为4mg?kg-1?d-1，给药体积为10ml?kg-1，假手术组与UUO模型组则给予等量生理盐水灌胃，每天一次，连续14天。在实验中通过HE、Masson染色，光镜观察肾组织病理变化及肾脏组织结构受损情况；免疫组化法检测肾组织中TGF-β1、α-SMA、ColⅠ、PAI-1、FAK、Src、NOX4的蛋白表达，并进行半定量分析。
2.建立肌成纤维细胞活化的体外细胞模型，将处于对数生长期的人肾小管上皮细胞（humantubularepithelialcells,HK-2）用胰酶消化后以1×106个细胞/孔接种于6孔板中，培养于含10%FBS的DMEM培养基中，放置于37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜，细胞密度达90%以上。MTT法检测不同剂量（设蚓激酶7个质量浓度：20，40，60，80，100，120，140U?mL-1）蚓激酶对HK-2活性的影响。找出最佳给药浓度后，将HK-2细胞分为正常组、模型组、贝那普利组以及蚓激酶低、中、高剂量组。各组细胞提取总RNA，鉴定纯度、完整性后，反转录合成cDNA，以反转录产物为模板，加入相应引物，进行荧光定量PCR反应，反应结束后自动生成溶解曲线，结果以Ct值表示，采用2-△△Ct法检测检测α-SMA、ColⅠ、FN、PAI-1、FAK、Src、NOX4的表达水平；提取蛋白，进行Westernblotting检测α-SMA、ColⅠ、FN、PAI-1、FAK、Src、NOX4的蛋白表达水平，检测的图片使用ImageJ对条带的灰度值定量分析。
3.各组大鼠实验数据应用SPSS17.0统计软件根据方差齐性结果，选择进行单因素方差分析及非参数检验，根据分析结果了解各指标间的相互关系，初步探讨蚓激酶抑制肾间质纤维化的可能机制。
结果：
1.动物实验：光镜结果显示，UUO模型组肾小管上皮细胞变性坏死，间质纤维组织增生，蚓激酶各组和贝那普利与模型组相比均明显减轻，差异具有统计学意义（均p＜0.05）；免疫组化结果表明，UUO模型组TGF-β1、α-SMA、ColⅠ、PAI-1、FAK、Src、NOX4蛋白的表达水平均比正常组明显增加（均p＜0.05），蚓激酶各组、贝纳普利组与模型组相比均减少（均p＜0.05）。
2.细胞实验：荧光定量PCR和Westernblotting检测结果显示，与模型组相比，蚓激酶各组和贝纳普利组均能减少α-SMA、ColⅠ、FN、PAI-1、FAK、Src、NOX4蛋白的表达程度（均p＜0.05）。
结论：
蚓激酶对RIF具有很好的防治作用，其机制可能是通过抑制TGF-β1、α-SMA、ColⅠ、FN、PAI-1、FAK、Src、NOX4蛋白的表达，减轻肾间质的病理损害、调控纤维化因子、抑制表型转化、降解基质蛋白、调节FAK-Src信号通路、减轻氧化应激，从而干预肾间质纤维化的进展。
肾间质纤维化（renalinterstitialfibrosis,RIF）是各种慢性肾脏疾病（chronickidneydisease,CKD）进展为终末期肾功能衰竭的共同结果，其发生发展是由细胞因子的产生、正常固有细胞的表型转化、细胞外基质（extracellularmatrix,ECM）的大量堆积等多种因素相互作用的结果。本实验选择与肾间质纤维化密切相关的促纤维化因子的释放、ECM的分泌及氧化应激等多方面为切入点，从整体、细胞两个层面验证蚓激酶对肾间质纤维化的保护作用可能是通过调节转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscleactin,α-SMA）、I型胶原蛋白（typeⅠcollagen,Col-Ⅰ）、纤维连接蛋白（fibronectin,FN）、纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogenactivatorinhibitor-1,PAI-1）、黏着斑激酶（focaladhesionkinase，FAK）、Src以及激酶氧化酶4（NADPHoxidase4,NOX4），从而延缓肾间质纤维化的发展，为中医药防治肾脏纤维化提供科学依据。
方法：
1.健康的SD大鼠适应性饲养1周后随机分为6组，假手术对照组、UUO模型组、贝那普利组以及蚓激酶低、中、高剂量组，建立经典的大鼠单侧输尿管梗阻模型（unilateralureteralobstruction,UUO），使其逐渐发展成为肾间质纤维化。从造模后第2天开始对治疗组采用灌胃法进行药物干预，蚓激酶低、中、高剂量分别为0.9×105U?kg-1、1.8×105U?kg-1、3.6×105U?kg-1，贝那普利给药剂量为4mg?kg-1?d-1，给药体积为10ml?kg-1，假手术组与UUO模型组则给予等量生理盐水灌胃，每天一次，连续14天。在实验中通过HE、Masson染色，光镜观察肾组织病理变化及肾脏组织结构受损情况；免疫组化法检测肾组织中TGF-β1、α-SMA、ColⅠ、PAI-1、FAK、Src、NOX4的蛋白表达，并进行半定量分析。
2.建立肌成纤维细胞活化的体外细胞模型，将处于对数生长期的人肾小管上皮细胞（humantubularepithelialcells,HK-2）用胰酶消化后以1×106个细胞/孔接种于6孔板中，培养于含10%FBS的DMEM培养基中，放置于37℃、5%CO2的培养箱中培养过夜，细胞密度达90%以上。MTT法检测不同剂量（设蚓激酶7个质量浓度：20，40，60，80，100，120，140U?mL-1）蚓激酶对HK-2活性的影响。找出最佳给药浓度后，将HK-2细胞分为正常组、模型组、贝那普利组以及蚓激酶低、中、高剂量组。各组细胞提取总RNA，鉴定纯度、完整性后，反转录合成cDNA，以反转录产物为模板，加入相应引物，进行荧光定量PCR反应，反应结束后自动生成溶解曲线，结果以Ct值表示，采用2-△△Ct法检测检测α-SMA、ColⅠ、FN、PAI-1、FAK、Src、NOX4的表达水平；提取蛋白，进行Westernblotting检测α-SMA、ColⅠ、FN、PAI-1、FAK、Src、NOX4的蛋白表达水平，检测的图片使用ImageJ对条带的灰度值定量分析。
3.各组大鼠实验数据应用SPSS17.0统计软件根据方差齐性结果，选择进行单因素方差分析及非参数检验，根据分析结果了解各指标间的相互关系，初步探讨蚓激酶抑制肾间质纤维化的可能机制。
结果：
1.动物实验：光镜结果显示，UUO模型组肾小管上皮细胞变性坏死，间质纤维组织增生，蚓激酶各组和贝那普利与模型组相比均明显减轻，差异具有统计学意义（均p＜0.05）；免疫组化结果表明，UUO模型组TGF-β1、α-SMA、ColⅠ、PAI-1、FAK、Src、NOX4蛋白的表达水平均比正常组明显增加（均p＜0.05），蚓激酶各组、贝纳普利组与模型组相比均减少（均p＜0.05）。
2.细胞实验：荧光定量PCR和Westernblotting检测结果显示，与模型组相比，蚓激酶各组和贝纳普利组均能减少α-SMA、ColⅠ、FN、PAI-1、FAK、Src、NOX4蛋白的表达程度（均p＜0.05）。
结论：
蚓激酶对RIF具有很好的防治作用，其机制可能是通过抑制TGF-β1、α-SMA、ColⅠ、FN、PAI-1、FAK、Src、NOX4蛋白的表达，减轻肾间质的病理损害、调控纤维化因子、抑制表型转化、降解基质蛋白、调节FAK-Src信号通路、减轻氧化应激，从而干预肾间质纤维化的进展。