牙齿发生是外胚层来源的上皮和神经嵴来源的间充质相互作用的结果。其中,上皮或间充质组分须有一者具备诱导成牙潜能。早期牙胚重组实验证明:在胚胎发育12.5天(E12.5)前,牙胚的诱导成牙潜能位于牙上皮中;在E12.5后,牙胚的诱导成牙潜能转移至牙间充质中。具备诱导潜能的牙胚组织均能诱导非牙胚组织,共同发育形成牙齿。利用干细胞组织工程实现的牙齿再生,同样需要上皮或间充质来源的干细胞具备诱导成牙潜能,但是目前还没有哪一类干细胞被证明拥有这一潜能。因此,解析诱导成牙潜能的关键分子构成是实现牙齿再生的关键,也是目前该领域内的研究热点和难点。磨牙牙胚还具有打散后重聚成牙的潜能。前期研究发现,具备诱导成牙潜能的E13.5磨牙间充质打散成单细胞体外培养8h后不再具备诱导成牙潜能,培养9d后甚至丧失被诱导成牙潜能;同样具备诱导成牙潜能的E14.5磨牙间充质体外培养24h后诱导成牙潜能显著下降,培养48h后该潜能完全丢失。因此,本研究分别收集E13.5磨牙间充质打散后体外培养0h、8h和9d的细胞样本(4次生物学重复)以及E14.5磨牙间充质体外培养0h、24h和48h的组织样本(3次生物学重复)进行RNA-Seq分析,力图利用转录组的差异表达,筛查诱导成牙潜能的分子构成。在RNA-Seq分析方法中,尽管不同生物信息学分析方法对同一数据的处理会产生不一样的分析结果,但往往那些显著差异的关键基因都能在多种分析方法中被解析出来,因此,本研究分别利用Tophat2-Cufflinks-Cuffdiff和HISAT2-FeatureCounts-DESeq2生物信息学方法同时分析E13.5和E14.5磨牙间充质细胞的RNA-Seq数据,以Fold-change(FC)≥2、FDR≤0.001为阈值,各自筛选出34个和23个在E13.5和E14.5磨牙间充质(0h)中均显著表达的差异基因。进一步通过Venn分析,发现在这两种生物信息学方法筛选获得的差异基因中共有15个基因是相同的,其中Sfrp5(Secreted frizzled-related protein5,Sfrp5)与牙齿发育密切相关。经检测,Sfrp5在E12.5小鼠磨牙牙胚中微弱表达,在E13.5和E14.5小鼠磨牙间充质和上皮中均强烈表达,但随着磨牙的继续发育,其表达水平不断减弱。此外,在体外培养8h的E13.5牙间充质细胞中验证了Sfrp5的表达水平显著下调。为验证Sfrp5在小鼠牙间充质细胞诱导成牙潜能中的生物学功能,将SFRP5蛋白添加至E13.5磨牙间充质细胞中共同培养8h后发现,外源添加SFRP5蛋白能有效维持小鼠磨牙间充质细胞中关键成牙因子Msx1和Lhx6的表达;进一步将SFRP5蛋白共培养8h后的E13.5磨牙间充质细胞与第二鳃弓上皮(非牙源性上皮)重组,能发育形成牙齿结构,此时的牙间充质细胞能有效诱导第二鳃弓上皮向成釉质细胞分化并分泌牙釉质(对照组嵌合体成牙率为0%,SFRP5处理组嵌合体成牙率高达43.5%)。结果充分说明Sfrp5的功能与小鼠磨牙间充质细胞诱导成牙潜能的维持密切相关。进一步的研究发现,外源添加SFRP5蛋白能有效提高E13.5磨牙间充质细胞中的Wnt/β-catenin活性和Wnt/PKC活性,使Wnt活性保持在一定阈值的稳态水平。本研究结果表明,Sfrp5可能是牙间充质细胞维持诱导牙齿发育潜能的关键因子之一。通常,Sfrps家族成员作为Wnt信号通路的拮抗物,能抑制其活性水平。但,也有研究表明Sfrps能与Wnt的Frizzled受体相互作用,激活Wnt的信号传导。我们的研究发现,与在牙齿发育过程中其他Sfrps不同(如Sfrp1、Sfrp2和Sfrp3均作为Wnt通路的拮抗剂调控牙齿的形态发生和牙齿萌发等过程),Sfrp5可能起到激活或维持Wnt信号活性的功能,保持牙间充质细胞的Wnt信号的稳态,对维持其诱导成牙潜能具有重要的作用。本研究为进一步探讨成牙潜能的分子构成奠定了基础。