论文部分内容阅读
白细胞介素18能明显诱导Th1和NK细胞产生IFN-γ，还可诱导IL-2、GM-CSF及TNF-α等多种细胞因子的产生。IL-18不但具有抗病毒、抗肿瘤活性，也可作为加强和改善机体免疫应答的免疫佐剂，与病毒的保护性抗原基因共表达可加强和改善机体的免疫应答。在某些疾病中监测IL-18的水平可以动态观察和了解疾病的发展、转归以及机体的免疫反应规律，所以有必要利用抗IL-18单克隆抗体建立相应的检测方法。到目前为止，国内外已有人、小鼠、猴、猪、牛和羊等种属的IL-18商品化制剂及其相应的单克隆抗体(McAb)或多克隆抗体(PcAb)以及夹心ELISA试剂盒的商品化供应。但目前，国内尚未见鸡IL-18单抗制备方面的报道。本课题对鸡IL-18(ChIL-18)成熟蛋白的单克隆抗体进行了研究。将鸡IL-18的成熟蛋白基因经扩增后亚克隆入原核表达载体pET-28a(+)中，经PCR、双酶切和测序鉴定后，构建了重组质粒pET-28a-mChIL18。将该质粒转化入高效表达菌Rosetta(DE3)的感受态细胞中，利用IPTG诱导表达得到大小为23KDa的融合蛋白，并利用载体上所带有的His标签蛋白这一特点，采用Ni-NTA亲和层析法纯化重组蛋白ChIL-18，从而获得了纯度较高的蛋白，其含量最高可达7.8mg/mL，最低为1mg/mL。利用纯化的重组ChIL-18蛋白对BALB/c小鼠进行免疫，并建立了检测小鼠抗体水平和单抗鉴定的间接ELISA检测方法。经反复试验确定了间接ELISA测定小鼠抗体水平以及筛选阳性杂交瘤细胞株的最佳反应条件，最佳抗原包被质量浓度为4μg/mL，阴阳性血清稀释倍数为1:10~4，羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释倍数为1:4000，抗原抗体最佳结合时间是1.5h，血清与二抗最适反应时间是1h。融合前抗体效价达到1:106，满足融合时对小鼠抗体的要求。SP2/0骨髓瘤细胞与加强免疫后的小鼠脾细胞在PEG作用下进行融合，经间接ELISA方法检测融合细胞，经过3次亚克隆筛选出能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，最终确定两株单抗2E6和1G9作为试验研究对象，并大量制备了单抗腹水。两株单抗亚型鉴定表明，均属于IgM亚型。1G9和2E6的腹水效价分别为1:5.12×10~5和1:3.2×10~4。ELISA叠加试验分析表明，1G9和2E6可分别结合到IL-18不同的抗原位点上，两者具有叠加性。Western blot鉴定结果表明，单抗2E6和1G9只能与重组ChIL-18蛋白发生特异性反应，不能与相同原核表达质粒及相同表达系统表达的新城疫NP蛋白、禽偏肺病毒G蛋白发生特异反应，从而排除单抗对His标签反应。IFA鉴定表明，重组真核质粒pcDNA3.1-mChIL18转染293T细胞，有目的蛋白表达，试验证实单抗可以特异性检测真核质粒在细胞上的表达，且产生特异性明显荧光。