论文部分内容阅读
氰烯菌酯（2-氰基-3-氨基-3-苯基丙烯酸乙酯,试验号：JS399-19）是由国家南方农药创制中心江苏基地最新合成的一种对镰孢菌具有较高活性的化合物,特别是对禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）菌丝生长具有强烈的抑制活性,田问也具有良好的防效。但是在离体条件下,通过紫外诱变和药剂驯化,禾谷镰孢菌对氰烯菌酯较易产生抗药性,且大部分抗药性菌株都属于中等抗性水平（MR）或高等抗性水平（HR）,抗性菌株的适合度并无明显下降,禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的室内抗药性具有高等至中等风险。在田间出现抗药性之前研究禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗药性机制,对科学制定该杀菌剂的应用策略和检测技术具有重要意义。本文建立了禾谷镰孢菌原生质体高效遗传转化技术平台。以氰烯菌酯高抗（JS399-19HR）菌株Y2021A为供试菌株,优化胞壁降解酶系统和潮霉素磷酸转移酶基因（hph）转化系统,结果发现,制备禾谷镰孢菌原生质体最适宜的条件为每毫升2%Drislase和2%Snailase混合酶液中加入0.12 g幼殖体,30℃酶解1.5 h, hph的转化效率可以达到40-50个转化子/μg DNA片段。利用禾谷镰孢菌原生质体高效遗传转化技术平台,分别将hph和正负筛选标记基因（hph-hsv）转化到JS399-19HR菌株Y2021A中,建立随机插入突变体文库,并筛选氰烯菌酯敏感性突变体。本研究共获得hph随机插入突变体10163个,其中10125个能在100μg/mL潮霉素B的PSA平板上正常生长,被认定为hph随机插入阳性突变体,但这些阳性突变体在10μg/mL氰烯菌酯上均能正常生长,表现出发菌株所表现的抗药性；共获得hph-hsv随机插入突变体4745个,其中4336个能在100μg/mL潮霉素B的PSA平板上正常生长而不能在0.2M的F2du上生长,被认定为hph-hsv随机插入阳性突变体,在hph-hsv随机插入阳性突变体中有328个突变体对氰烯菌酯表现敏感,这些突变体被认为是氰烯菌酯敏感性突变体,并被用来研究禾谷镰孢菌对氰烯菌酯抗药性相关基因的材料。以氰烯菌酯敏感性突变体为研究材料,通过Tail-PCR扩增hph-hsv的侧翼序列,并与Fusarium graminearum基因文库进行比对,结果发现hph-hsv插入在tubulin beta chain （FGSG06611.3） （β2-tub）中。经PCR、测序、Southern blot知RT-PCR的进一步验证,hph-hsv不是插入到β2-tub中,而是替换了β2-tub的编码区。将不同抗药性水平菌株与禾谷镰孢菌野生型菌株2021的β2-tub进行比对,发现其β2-微管蛋白的12、17、21、22、41和74位氨基酸分别发生了不同的改变。通过对禾谷镰孢菌野生型菌株2021和JS399-19HR菌株JT04-4的p2-tub敲除体/回复体和JS399-19HR菌株Y2021A的敏感性突变体研究,结果表明,氰烯菌酯对野生型菌株2021 p2-tub敲除体和敏感性突变体的生长抑制中浓度EC5o值与对野生型菌株2021的EC5o值没有显著差异,但是最低抑制浓度MIC值下降了4倍。JS399-19HR菌株JT04-4β2-tub敲除体对氰烯菌酯抗性水平下降,表现中抗。与野生型菌株2021相比,β2-tub敲除体和敏感性突变体的菌丝生长速率、产分生孢子能力、产子囊壳能力及致病力均显著下降,但是敏感性突变体较p2-tub敲除体下降的幅度小。不同类型菌株的β2-tub回复体对氰烯菌酯则表现出与出发菌株相同的抗药性水平,其菌丝生长速率、产分生孢子能力、产子囊壳能力及致病力也基本恢复。本研究结果表明,β2-tub基因敲除和hph-hsv插入缺失是禾谷镰孢菌对氰烯菌酯抗药性下降和丧失的重要机制。通过禾谷镰孢菌蛋白质双向电泳图谱分析,研究了氰烯菌酯对野生型敏感菌株2021和JS399-19HR菌株Y2021A蛋白质组学的影响。用EC90（0.5μg/mL）浓度的氰烯菌酯处理野生敏感菌株2021和JS399-19HR菌株Y2021A 12h,同时以不加药剂作为对照。获得敏感菌株经药剂处理以后蛋白质表达量发生显著变化,而抗药性菌株未发生显著变化的蛋白质点38个,经MALDI-TOF-MS/MS质谱鉴定,38个蛋白点被鉴定出37个,成功率达到95%以上,但是其中16个蛋白是功能未知的蛋白质,将这些蛋白质的氨基酸序列在Broad数据库中进行检索,找出完整的蛋白序列,并进一步在NCBI数据库中进行检索,根据E-value值找出与其同源性最高的蛋白,推测其功能。结果表明,与氰烯菌酯抗性有关的功能蛋白可以分为代谢相关蛋白、运动相关蛋白、调控相关蛋白、细胞信号传导相关蛋白以及其他蛋白。代谢相关蛋白有丙酮酸脱羧酶、丙酮酸激酶、转氨酶、ACC脱氨酶、组蛋白乙酰转移酶、氨酰-tRNA合成酶和谷氨酰胺合成酶等；运动相关蛋白有ARP2/3复合物和驱动蛋白1；调控相关蛋白有真核翻译起始因子3亚基、真菌特异性转录因子、线粒体载体蛋白、30KDa热休克蛋白、热休克蛋白SSC1、ATP结合盒转运蛋白亚家族F和LAGLIDADG endonuclease等；信号传导相关蛋白有GTP绑定核蛋白和腺甘酸环化酶相关蛋白。氰烯菌酯对禾谷镰孢菌能量代谢系统影响较小而对氨基酸代谢系统、调控系统和信号传导系统影响较大,由于氰烯菌酯与现有的苯并咪唑类、麦角甾醇生物合成抑制剂类、甲氧基丙烯酸酯类、二硫代氨基甲酸盐类和取代芳烃类杀菌剂均无交互抗性,其作用机制新颖,而禾谷镰孢菌对氰烯菌酯较易产生抗药性,且大部分抗性菌株都属于中等抗性水平（MR）或高等抗性水平（HR）,由此可以推测禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的抗药性可能是由调控相关蛋白或信号传导相关蛋白的表达变化引起的。