研究目的肝移植手术是目前临床上治疗各种终末期肝病的最有效手段。排斥反应是移植术后常见的并发症,也是影响移植器官存活的重要因素。因此,器官移植成功的关键就是抑制受体的免疫系统从而预防排斥反应的发生,最有效的手段就是合理的选择和使用免疫抑制剂。目前临床上常用的免疫抑制三联方案为:他克莫司联合吗替麦考酚酸酯与糖皮质激素。其中,他克莫司因其有效治疗浓度范围窄,个体差异大,不良反应严重等药动学和药效学特征而需要通过血药浓度监测来调整其给药剂量。然而,由于血药浓度监测存在明显的滞后性,只能从一定程度上降低移植术后急性排斥反应和药物毒副作用的发生率。因此,找到影响他克莫司体内代谢过程的关键因素并确定其为生物标记物,在给药前即根据患者个体差异来确定个体化给药剂量,对于移植术后他克莫司应用的有效性和安全性有着更加重要的指导意义。目前关于他克莫司血药浓度个体差异原因的研究,主要集中在遗传药理学方面,且大多结论不尽一致。这提示他克莫司在人体肝脏的代谢过程,可能也受表观遗传学因素的影响,有待系统深入研究。同时,由于肝脏是药物代谢最重要的器官,在肝移植中,现有研究已提示供体肝脏在术后药物代谢研究中占据着更重要的地位。因此,肝移植术后他克莫司初始血药浓度监测结果更能反映出供体肝脏的个体差异。本研究拟以肝移植患者术后初始血药浓度为依据,观察供体肝脏遗传学和表观遗传学因素对肝移植患者术后他克莫司血药浓度的影响,力求明确、完善他克莫司在人体内的代谢途径以及影响其代谢过程的调控因素,以确定对临床制定他克莫司个体化给药方案具有指导意义的生物标记物。一、供体肝脏遗传学因素对他克莫司血药浓度的影响方法1.研究对象筛选及肝移植供体肝脏组织标本的收集本研究通过对郑州大学第一附属医院肝移植中心2016年6月至2018年6月的肝移植患者临床资料、术后免疫抑制剂给药方案及他克莫司初始血药浓度检测结果等进行分析,筛选出初始血药浓度差异较大(高浓度组>10μg/L,低浓度组<5μg/L)的两组共计78例患者,从河南省消化器官移植重点实验室生物样本库中获取此78例患者的供体肝脏标本(伦理号2019-KY-019)。2.78例供体肝脏组织DNA的提取及基因多态性的检测提取供肝组织DNA,PCR扩增目的DNA片段,参考现有文献,检测CYP3A5、CYP3A4、CYP3A7、UGT1A4、UGT2B7及ABCB1在亚洲人群中的常见单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点并和他克莫司初始血药浓度/剂量(concentration/dose,C/D)值进行对比分析,明确可能参与他克莫司代谢途径的药物代谢酶或转运体以及影响肝移植术后他克莫司初始血药浓度的SNP位点。3.携带CYP3A5*3/*3供体肝脏组织RNA的提取及全转录组测序根据基因多态性的检测结果,在携带CYP3A5*3/*3基因型的供体肝组织(共计36例)中筛选出依然存在他克莫司初始血药浓度差异的23例样本。将其分成高、低血药浓度组(高浓度组>10μg/L,低浓度组<5μg/L),提取组织RNA,进行全转录组测序并对测序结果进行分析。结果1.肝移植供体基因多态性与受体术后他克莫司初始血药浓度之间的相关性(1)CYP3A酶基因多态性:①78例肝移植供体CYP3A5表达型(CYP3A5*1/*1,CYP3A5*1/*3)与 CYP3A5 不表达型(CYP3A5*3/*3)相比,受体术后他克莫司初始血药浓度C/D值之间具有显著性差异(P=0.0026)。但携带CYP3A5*3/*3供体的肝移植患者中,他克莫司初始血药浓度仍存在较大个体差异。②供体CYP3 A4*1/*1基因型和携带CYP3 A4*1G基因型(*1/*1G+*1G/*1G)的他克莫司初始C/D值之间存在显著性差异(P=0.003)。③供体CYP3A7 rs2257401位点的GG型与GC+CC型相比,受体术后他克莫司初始血药浓度C/D值之间具有显著性差异(P=0.0028);供体CYP3A7 rs10211位点的AA型与GG+GA型相比,受体术后他克莫司初始血药浓度C/D值之间也具有显著性差异(P=0.041)。(2)UGT酶基因多态性:①78例供体肝组织中,UGT1A4的5个SNP位点之间存在连锁不平衡效应,但各位点的不同基因型之间的受体术后他克莫司初始血药浓度C/D值均无显著性差异(P=0.66)。②UGT2B7的5个SNP位点之间存在连锁不平衡效应,但各位点不同基因型之间的受体术后他克莫司初始血药浓度C/D值并不存在显著性差异(P=0.77)。(3)ABCB1基因多态性:78例供体肝组织中,ABCB1基因3个SNP位点不同基因型之间的受体术后他克莫司初始血药浓度C/D值均不存在显著性差异(P=0.29、0.60、0.50)。2.全转录组测序中表达差异基因的分析对23例他克莫司初始血药浓度存在显著差异的CYP3A5*3/*3基因型供体肝脏组织进行全转录组测序,结果显示,CYP3A4和CYP3A7的基因表达量和受体术后他克莫司初始C/D值之间不存在相关性(r=0.146、0.092;P>0.05),且CYP3A7的表达量远低于CYP3A4的表达量;Ⅱ相代谢酶中的UGT2B7、UGT1A4、UGT1A1以及转运体ABCB1的基因表达均与术后他克莫司初始C/D值之间存在明显相关性(r=-0.427、-0.432、-0.516、0.515;P<0.05)。同时结果还显示,肝细胞核因子4α(hepatic nuclear factor 4α,HNF4α)的表达量也和血药浓度呈负相关,且和 UGT2B7、UGT1A1、UGT1A4 均存在显著正相关(r=-0.507、0.692、0.413、0.635;P<0.05)。该结果提示,他克莫司的体内代谢可能经Ⅱ相UGT酶代谢。二、HNF4α/HNF4α-AS1/UGT1A4通路对他克莫司血药浓度的影响方法1.体外酶实验检测他克莫司的Ⅱ相代谢途径(1)他克莫司的体外重组单酶筛选:建立他克莫司葡萄糖醛酸结合反应孵育体系,将重组表达的UGTs单酶UGT1A1、UGT1A3、UGT1A4、UGT1A6、UGT1A7、UGT1A8、UGT1A9、UGT1A10、UGT2B4、UGT2B7、UGT2B10、UGT2B15、UGT2B17 及人肝微粒体(human livermicrosomes,HLM)分别和他克莫司标准品共孵育,通过液相-质谱分析方法检测他克莫司的葡醛酸代谢产物。(2)化学抑制定性实验:分别在孵育体系中加入UGT1A1、UGT1A4、UGT1A9、UGT2B7酶的化学抑制剂,对他克莫司在HLM中的葡萄糖醛酸化代谢进行抑制,质谱检测分析他克莫司的葡醛酸化代谢产物,通过代谢产物的减少程度进一步确定他克莫司对UGT1A4单酶的选择性。2.携带CYP3A5*3/*3供体肝脏组织中UGT1A4及HNF4α、HNF4α-AS1 mRNA表达的测定采用qPCR检测23例具有他克莫司血药浓度差异的CYP3A5*3/*3基因型供体肝组织中UGT1A4、HNF4α、HNF4α-AS1的mRNA表达水平,并分析它们和受体术后他克莫司初始C/D值的相关性。3.HNF4α及HNF4α-AS1敲除Huh7细胞系的建立及UGT1A4表达水平的检测采用功能缺失性实验在人肝癌细胞系Huh7细胞中分别敲除HNF4α和HNF4α-AS1,采用 RT-qPCR 和 Western Blot 检测细胞中 HNF4α、HNF4α-AS1及UGT1A4的mRNA和蛋白表达水平。结果1.UGT1A4是直接代谢他克莫司的Ⅱ相代谢酶他克莫司体外葡萄糖醛酸化代谢实验结果显示,只有UGT1A4表现出明显催化活性,且是其他重组亚型酶的35倍左右;在混合HLM中加入不同亚型UGT酶的化学抑制剂后,UGT1A4(海格吉宁)和UGT1A1(尼洛替尼)抑制剂对他克莫司的葡萄糖醛酸化代谢具有明显抑制,抑制后的代谢残余活性分别为42%和38%左右,而其他单酶抑制剂加入后的残余活性仍在80%以上。该结果表明UGT1A4是直接代谢他克莫司的重要Ⅱ相代谢酶。2.UGT1A4、HNF4α、HNF4α-AS1在供体肝脏组织中的mRNA表达水平23例携带CYP3A5*3/*3基因型的供体肝组织中,UGT1A4和HNF4α mRNA表达水平均与他克莫司初始血药浓度呈负相关(r=-0.418、-0.453;P<0.05),且HNF4α和UGT1A4 mRNA表达水平呈显著正相关(r=0.614;P<0.05)。HNF4α-AS1和HNF4α、UGT1A4 mRNA表达水平也均呈明显正相关(r=0.505、0.416;P<0.05)。该结果提示,HNF4α/HNF4α-AS1通路有可能通过调节UGT1A4的表达影响他克莫司的血药浓度。3.siRNA干扰HNF4α或HNF4α-AS1对UGT1A4表达的影响siRNA干扰实验结果显示,敲低HNF4α后,与对照组相比,细胞内HNF4α、HNF4α-AS1 及 UGT1A4 mRNA 表达水平均明显下降(P<0.001),HNF4α 和UGT1A4蛋白表达量也有明显降低。而在敲低HNF4α-AS1后,与对照组相比,HNF4α和UGT1A4 mRNA表达水平均升高,蛋白表达量也升高。结果提示,HNF4α-AS1可能作为辅助因子与HNF4α相互作用,从而调控UGT1A4的表达。三、ABCB1启动子区DNA甲基化对他克莫司血药浓度的影响方法1.携带CYP3A5*3/*3供体肝脏组织DNA甲基化的检测采用Illumina850甲基化芯片测序技术对23例携带CYP3A5*3/*3供体肝脏组织中的15例标本(每例标本DNA约500ng)进行全基因组DNA甲基化程度检测,筛选出对他克莫司血药浓度差异有意义的甲基化位点,再用焦磷酸化测序技术对全部23例标本该位点的甲基化程度进行验证。2.qPCR检测肝脏组织ABCB1 mRNA表达水平采用qPCR检测23例具有他克莫司血药浓度差异的CYP3A5*3/*3供肝组织中ABCB1的mRNA表达水平,分析mRNA表达水平和他克莫司血药浓度以及和DNA甲基化程度之间的相关性。3.细胞水平检测ABCB1启动子区甲基化对ABCB1转运他克莫司的影响分别用0、10μmol/L的甲基化抑制剂5-Aza-2-dC处理HepG2细胞72h后,更换含60μmol/L他克莫司的培养基,48h后撤去含他克莫司的培养基,更换为不含他克莫司的培养基继续培养,分别于更换后0、4、6、12h后收集细胞。采用RT-qPCR和Western Blot检测HepG2细胞中ABCB1的mRNA和蛋白表达水平的变化;采用焦磷酸测序检测细胞内ABCB1基因甲基化程度的改变;同时采用液相-质谱检测细胞中他克莫司的浓度变化。结果1.携带CYP3A5*3/*3供体肝脏组织全基因组甲基化测序分析结果甲基化芯片筛选结果显示,供体肝脏组织内ABCB1的三个甲基化位点(cg12501229,cg00634941,cg05496710)与他克莫司初始血药浓度水平相关。焦磷酸化检测进一步验证后结果显示,供体ABCB1这三个位点的甲基化程度在他克莫司血药浓度高、低组中存在显著性差异(P<0.05)。2.携带CYP3A5*3/*3供体肝脏组织中ABCB1的mRNA表达水平qPCR检测结果显示,供体肝脏组织中ABCB1 mRNA表达水平和他克莫司初始血药浓度呈显著正相关(r=0.458;P<0.05),且ABCB1三个CpG位点的甲基化程度均和ABCB1 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.273、-0.292、-0.195)。由此说明,ABCB1的启动子区甲基化可能是影响术后他克莫司血药浓度的另一重要因素。3.5-Aza-2-dC对HepG2细胞代谢他克莫司的影响甲基化酶抑制剂5-Aza-2-dC处理HepG2细胞后,细胞中ABCB1 mRNA和蛋白表达水平均有明显升高;ABCB1三个CpG位点的甲基化程度与未处理组相比均有明显减少(P<0.05);在撤去他克莫司培养基后的0、4、6、12h,细胞中他克莫司的含量与未处理组相比也均有明显减少(P<0.05)。由此证明,转运体ABCB1基因启动子区甲基化通过调控ABCB1的表达进而影响他克莫司在细胞内的代谢过程。结论1.供体CYP3A5*3和CYP3A4*1G的基因多态性是影响肝移植术后他克莫司血药浓度差异的重要因素,但并不能完全解释个体差异。2.UGT1A4是人体内直接代谢他克莫司的重要Ⅱ相代谢酶,且HNF4α/HNF4α-AS1通路是调控UGT1A4差异表达进而影响肝移植术后他克莫司血药浓度的因素。3.供体ABCB1启动子区DNA甲基化通过调控ABCB1的表达进而影响肝移植术后他克莫司的血药浓度。