铁皮石斛原球茎发育过程中DoWOX与DoSERK的表达分析

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铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migom)属兰科植物,是一种名贵的中药材。兰科植物种子萌发都要经过原球茎中间结构才能形成幼苗,原球茎发育实际上是胚胎发育与种子萌发这两个过程的结合。在原球茎发育的P1与P2时期有大量基因差异性表达,主要涉及的通路有:氨基酸生物合成、激素信号转导、植物与病原菌相互作用等。WOX基因在分生组织干细胞稳定性维持、侧根发育、胚胎发育等过程发挥作用。本研究通过同源比对方法,从铁皮石斛基因组中分离并鉴定出11条DoWOX基因。其中,DoWOX1、DoWOX2、DoWOX3、DoWOX4、DoWOX5与DoWOX11属于现代支;DoWOX6、DoWOX7与DoWOX10属于中间支;DoWOX8与DoWOX9属于远古支。蛋白DoWOX3、DoWOX4与DoWOX11羧基端含有典型WUS-box基序。DoWOX蛋白的同源异形结构域(HD)一致性为61.4%,含有68-69个氨基酸残基,共有基序为:X4-RW-X-P-X3-Q-X3-L-X7-G-X3-P-X4-L-X3-G-X6-V-X2-WFQN-X3-R-X7(X为不一致的氨基酸残基);同源建模结果显示铁皮石斛WOX蛋白的HD都有“螺旋-环-螺旋-转角-螺旋”空间结构。定量表达结果显示,除DoWOX7在原球茎发育过程中不表达外,其它10个DoWOX基因全部在原球茎发育过程中差异表达。其中,DoWOX1、DoWOX2、DoWOX3、DoWOX4、DoWOX6、DoWOX9、DoWOX10和DoWOX11这8个基因在种胚活化期表达量最高,TSS上游调控元件分析显示这些基因的调控区含有多个光响应元件。DoWOX5只在原球茎基部退化期与幼苗中表达,说明它可能不参与原球茎发育,只在成熟植物中表达。DoWOX8在顶端分生组织形成期表达量最高,可能与顶端分生组织发育相关。体细胞胚发生相关类受体蛋白激酶(Somatic embryogenesis receptor-like kinase,SERK)广泛存在于植物界,具有多种生物学功能。通过同源比对方法从铁皮石斛scaffold数据中鉴定出2个SERK基因,命名为DoSERK1和DoSERK2。DoSERK1与DoSERK2的CDS长分别为1902bp与1877bp,分别编码633与628个氨基酸,都具有典型的SERK蛋白结构。Conserved domains预测发现DoSERK2胞内激酶活性位点在其三维结构凹槽处,DoSERK1胞内激酶区对应位置也有相似的凹槽。克隆DoSERK2的3’端,发现其3’-UTR区长178 bp。定量表达结果显示DoSERK1在原球茎发育前期表达量逐渐上升,至P4时期(顶端分生组织形成期)表达量达到最高,随后表达量呈逐步降低趋势,但P7时期(根分生组织形成期)表达量最低。可推测,DoSERK1可能在顶端分生组织与叶片形成过程中起重要作用。DoSERK2在原球茎发育各个时期均有表达但在P1时期(种胚活化期)表达量最高,P2-P9时期表达量基本持平;而组织表达分析显示DoSERK2在各组织器官广泛表达,但在花中表达量最高;花和原球茎发育的种胚活化期都可看作是铁皮石斛胚胎发育阶段,由此可推测,DoSERK2在胚胎发育中发挥重要作用。本论文为铁皮石斛原球茎发育分子机理的阐述和DoWOX与DoSERK生物学功能的研究奠定了基础。
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