铝是地壳中最丰富的金属元素,在pH<5的酸性土壤中铝会以Al3+形式释放出来对植物产生毒害作用,影响农作物生长。随着全球土壤酸化程度上升,已有50%的可耕种土壤都是酸性土壤,因此铝毒已成为全球作物产量的一个主要限制因素,农业生产上植物耐铝毒研究成为关注的焦点。本实验室的前期研究在铝处理的丹波黑大豆SSH cDNA文库中发现GmbHLH30基因呈上调表达,并从丹波黑大豆根中分离鉴定了转录因子GmbHLH30基因,发现其过量表达GmbHLH30能增加烟草对铝的抗性。随后筛选出GmbHLH30的T-DNA插入拟南芥突变体的纯合子和转pK2G7-GmbHLH30过表达载体的转基因拟南芥,通过基因芯片杂交技术对这些转基因植物在铝胁迫条件下上调和下调的基因进行了聚类分析。本研究则对黑大豆响应铝胁迫过程中GmbHLH30耐铝分子机理进行了分析。另外,对拟南芥Prx64基因的耐铝能力进行了分析,并对其耐铝机理进行了探讨。主要研究结果如下:通过荧光定量PCR和蛋白印迹分析对丹波黑大豆根和叶中GmbHLH30转录水平和翻译水平的表达差异进行了分析。结果表明在铝胁迫诱导下,GmbHLH30在丹波黑大豆根中的表达量随着铝处理浓度的上升而明显上升,而叶中表达量比较低,表达量上升不明显,说明GmbHLH30在根中的表达受铝诱导,并且具有组织特异性。洋葱表皮瞬时表达分析表明激光共聚焦显微镜下能观察到GmbHLH30在细胞核中表达,GmbHLH30定位于细胞核中;通过染色质免疫共沉淀技术鉴定了 GmbHLH30可能调控的三个靶基因,GmMATE、GmSTOP1和GmALMT1 分别构建了 GmALMT1和 GmMate 的启动子载体 pHGWL7-pGmALMT1-LUC 和 pHGWL7-pGmMATE-LUC,在转GmbHLH30烟草叶片中瞬时表达植物表达载体pHGWL7-pGmM4ATE-LUC和pHGWL7-pGmALMT1-LUC,发现在转GmbHLH30基因植物叶片中瞬时表达pHGWL7-pGmMATE-LUC,能检测到报告基因LUC的活性,但瞬时表达pHGWL7-pGmALMT1-LUC叶片中LUC的活性则很低,说明GmbHLH30主要对GmMATE的启动子有转录活性,在铝胁迫下可能通过和GmMATE启动子的结合调控靶基因GmMATE的转录。随后在丹波黑大豆中分离鉴定了GmMATE 发现丹波黑大豆中该基因有缺失和突变,对其缺失和突变进行了分析,并将该基因命名为GmMATE-TB1;结果发现,GmMATE-TB1的cDNA序列相较数据库中GmM4ATE的序列,525位-530位6个碱基缺失,第30个碱基由T变A,第204个碱基由C变成T,第232个碱基由C变成T,第1331个碱基由C变成T,第1409个碱基由C变成T,第1538个碱基由T变成C。这些缺失和突变也导致了其编码蛋白序列的变化。对其结构进行了模拟分析,发现蛋白序列的变化对细胞外的结构产生了较大影响,但对其功能的影响还有待研究。此外,还构建植物表达载体pCAMBIA1300-GmMATE-TB1-GFP,对其亚细胞定位进行了初步研究,并对其可能的功能进行了分析;对丹波黑大豆根中GmbHLH30和GmMATE-TB1在铝、镉和锰胁迫下的表达情况进行了比较分析,发现在铝和镉胁迫下,两个基因的表达明显上调,而锰胁迫条件下,GmbHLH30和GmMATE-TB1的上调幅度较小,但GmMATE-TB1的上调幅度还是比较明显,这说明GmMATE-TB1调控的对金属离子的耐受途径可能是这些金属离子胁迫下的一个共同途径。此外,还表明除了 GmbHLH30对GmMATE-TB1的表达调控的途径外,可能存在其他的调控机制,这说明不同金属离子胁迫条件下丹波黑大豆响应的机制有所不同。此外,对拟南芥AtPrx64基因的耐铝功能及耐铝机制进行了分析。本实验室的前期研究表明,铝胁迫下,与野生型烟草比较,转AtPrx64烟草能提高根相对伸长量和可溶性蛋白含量,减少根尖的H202含量、MDA含量及铝的累积。转AtPrx64烟草通过提高质膜H+-ATPase磷酸化水平及其与14-3-3蛋白的相互作用水平来提高质膜H+-ATPase活性,促进柠檬酸分泌。本研究中发现与野生型烟草比较,转AtPrx64烟草能减少铝在烟草根尖的累积,并且AtPrx64基因的过表达还能增加根尖木质素形成。这些结果说明Prx64基因的过表达能通过减少铝在根尖的累积从而增加烟草对铝的耐受性,并且这个过程除了与柠檬酸的分泌相关,还可能与细胞壁结构的改变也有关。