目的 心脏重构是慢性心力衰竭发生发展中的基本病理生理过程,是许多严重心血管疾病进展为心力衰竭的最后共同通路,然而目前的研究并未完全阐明其发生的根本机制,以致目前对心脏重构的防治任重道远。本研究旨在阐明肿瘤坏死因子受体相关因子3(TRAF3)对病理性心脏重构的作用及具体机制。方法在动物实验中,本课题应用心脏特异性的TRAF3条件性敲除小鼠和心脏特异性TRAF3条件性转基因小鼠作为研究载体,利用主动脉缩窄术建立小鼠心脏重构模型。通过测量小鼠体重量、心脏重量、肺脏重量、胫骨长度,并计算肺重/体重、心重/体重以及心重/胫骨长度等指标评价心脏重构程度；通过心脏超声心动图,测量左室收缩末期内径、左室后壁舒张期厚度、左室舒张末期内径、左室后壁收缩期厚度、左室射血分数、左室短轴缩短率等评价心脏肥厚程度及心脏功能；通过心脏病理组织H&E染色、WGA染色比较大体心脏以及心肌细胞横截面积,评价心肌细胞肥大程度；通过心脏病理组织PSR染色,测量心脏组织间质胶原面积,评价心脏间质纤维化程度；通过实时荧光定量PCR检测心脏组织肥厚及纤维化相关因子表达水平,从分子水平评价心脏重构程度。在细胞实验中,采用新生大鼠心肌细胞作为研究载体,使用携带特异基因片段的腺病毒载体感染心肌细胞并调控其TRAF3表达,以AngⅡ刺激构建心肌细胞肥大模型,进而通过免疫荧光染色(抗a-Actin)测量心肌细胞面积及实时荧光定量PCR检测心肌肥大相关因子表达水平,评价心肌细胞肥大程度。以上实验在大体动物水平及细胞水平探讨了TRAF3在心脏重构中的作用。在机制研究中,首先应用蛋白免疫印迹方法(western blotting)筛查并锁定了介导TRAF3对心脏重构调节的AKT信号通路及下游靶基因,并使用AKT特异性抑制剂逆转TRAF3过表达产生的促心脏重构作用；通过免疫共沉淀(Co-IP)、免疫荧光染色激光共聚焦检测共定位、GST-Pull down验证TRAF3与TBK1的直接相互作用；mapping检测TRAF3与TBK1的结合结构域,从而从分子水平阐明TRAF3调控心脏重构的机制。结果在扩张型心肌病患者、肥厚型心肌病患者及压力负荷诱导的小鼠心脏重构模型心脏中,TRAF3表达量显著升高。心脏特异性的TRAF3条件性敲除小鼠经主动脉缩窄术处理四周后,其心脏重构程度较对照组显著减轻,而心脏特异性TRAF3条件性转基因小鼠在同样处理后心脏重构程度明显加重。通过腺病毒感染介导的新生大鼠心肌细胞TRAF3过表达或干扰内源性的TRAF3表达后,给予心肌细胞AngⅡ刺激48小时,发现TRAF3过表达显著促进心肌细胞的肥大,而抑制TRAF3表达则产生相反的结果。机制研究中,通过western blotting筛查介导TRAF3对心脏重构调节作用的相关信号通路时,发现AKT信号通路及其下游靶基因发生相应改变,推测该通路介导TRAF3对心脏重构的调节作用,并使用AKT特异性抑制剂MK-2206成功逆转TRAF3过表达引起的AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的恶化,从而证实了以上推测。进一步的机制研究发现,TRAF3可与TBK1直接相互作用,促进TBK1磷酸化,后者随后激活AKT信号通路,引起下游促心脏重构因子表达增加,从而导致心脏重构发生发展,其中TRAF3的267-376氨基酸结构域和TBK1的384-729氨基酸结构域介导TRAF3与TBK1的相互作用。结论本课题在大体动物和细胞水平证实了TRAF3能显著恶化病理性心脏重构,并从分子水平阐明TRAF3通过与TBK1直接相互作用促进其磷酸化,后者随后激活AKT信号通路,引起下游心脏重构因子表达增加,最终导致心脏重构发生发展的机制。本研究首次揭示TRAF3-TBK1-AKT这一心脏重构及心力衰竭相关信号通路,为探索心脏重构及慢性心衰的临床诊治新靶点、新策略提供了理论基础。