研究背景结直肠癌(Colorectal cacinoma, CRC)是全世界癌症发病率位于第3位的恶性肿瘤,每年新发病例达120万人,预计死亡病例超过60万人。我国结直肠癌位于恶性肿瘤发病率的第2位,位居肿瘤死亡率第4位。近几年来,虽然随着诊疗新技术的应用和化疗药物的不断更新,结直肠癌患者的治疗疗效得到了极大地改善,但患者总的生存率并没有明显地提高,其主要原因是一半以上的结直肠癌患者在行根治性手术前已出现了微转移。复发与转移是结直肠癌患者术后死亡的主要原因,肝脏是结直肠癌转移的主要靶器官,80%的患者因肝转移而死亡。因此,有必要加强结直肠癌转移相关机制的研究,明确靶器官微环境因素在结直肠癌转移中的作用,鉴定靶器官血管内皮细胞是否促进肿瘤细胞的侵袭和血管发生,可能有效提高结直肠癌患者生存率和治愈率。肿瘤转移是一个复杂的、多步骤的阶段演变过程。肿瘤细胞要完成转移过程,肿瘤细胞必须先脱离原发部位,侵人细胞外基质(ECM),与基底膜(BM)及ECM中一些大分子细胞蛋白成分粘附,并激活细胞合成分泌各种降解酶类,穿透血管壁进入循环系统,再穿透血管外渗到继发部位,与继发部位组织粘附形成克隆,增殖生长而形成转移灶,肿瘤细胞浸润转移与内皮细胞关系较密切。癌细胞产生的胶原酶和肿瘤生长因子(TGF)等能直接或间接引起内皮细胞活化,产生胶原酶原及血小板活化因子(PAF)使癌细胞在血管内形成肿瘤血栓,进而癌细胞产生蛋白分解酶,破坏细胞外基质和血管内皮细胞组成的基底膜,导致癌细胞的浸润及转移。肿瘤血行转移的关键步骤之一是血液中的癌细胞栓子附着在血管内皮上,血小板释放凝集素,使肿瘤细胞与内皮细胞粘附,血管内皮细胞收缩变圆,细胞连接间出现间隙,内皮层通透性增高,肿瘤细胞穿透血管壁,进入组织,形成转移灶。肿瘤细胞转移灶有其特定的器官,并非转移到肿瘤细胞遇到的第一个器官,这与肿瘤细胞优先粘附到靶器官的内皮细胞的能力相一致。在肿瘤细胞和内皮细胞粘附过程中,肿瘤细胞转移中的粘附因子以特定的方式表达。随着微血管培养技术的发展,发现具有器官特异性转移倾向的肿瘤细胞对不同组织来源的内皮细胞的亲和力也不相同,它们更易于粘附于靶器官来源的内皮。Pauh等发现癌细胞发生器官转移与肿瘤细胞特异性表达因子有关,它们以内皮细胞粘附因子为介导,靶器官微血管具有相应表型特征,共同调节内皮系统、细胞外基质与肿瘤细胞的相互作用(例如特异性的基质分子和生长因子),最终诱发血管发生而产生器官特异性的转移。当肿瘤组织>2mm时,需要生成新血管为肿瘤继续增殖提供充足的氧和营养,受控于多种血管生成因子(TAF)。正常的血管生成被严格控制于某些暂定的、特定的生理过程,如胚胎发生、器官发育和伤口愈合过程。而持续的血管生成是某些病理改变如肿瘤生长的特性。事实上,血管生成不但是肿瘤生长所必须的,而且肿瘤细胞与新生血管系统的接触还是导致远处转移的原因。肿瘤血管生成是一个连续的过程,肿瘤细胞释放出多种血管生成因子,血管内皮细胞(EC)因血管生成因子的作用而出现形态改变,包括各种细胞器数目和大小的增加以及伪足的出现。EC和肿瘤细胞释放蛋白酶以降解毛细血管基底膜和周围细胞外基质,其中1/4EC在肿瘤细胞的作用下从毛细血管后微静脉迁徙出来形成血管新芽；1/2EC产生增殖效应；3/4EC在肿瘤组织内形成肿瘤依赖的微血管系统,内皮细胞的迁移、增殖及肿瘤微血管发生的三种效应既具有独立性,又具有重叠性。血管生成因子是一大类生长因子或细胞因子类的多肤物质,这些物质直接或间接作用于血管内皮细胞,引起血管膨胀、内皮细胞变形、毛细血管芽向肿瘤组织内生长,并利用内皮细胞产生的一种蛋白因子封闭新生微血管开口端使之成为完整的管状结构。在肿瘤生长过程中,转移性新血管不断形成和生长,但血管生成抑制剂可抑制肿瘤转移。Oireilly等从肿瘤鼠血清和尿中,确定抑制内皮细胞增殖,系统控制新血管,可以减少Lewis肺癌的肿瘤转移。研究显示肿瘤转移初期,至少可通过抑制新血管生成来抑制。基于目前的研究现状,本实验针对肿瘤血行转移中的重要环节——肿瘤细胞与转移靶器官血管内皮相互作用这一关键节点产生的效应进行研究。我们选择结直肠癌转移靶器官肝脏血窦内皮细胞(HHSEC)为主要研究对象,应用结直肠癌细胞株SW480的高转移亚系SCP17、不转移亚系SCP40,以及结直肠癌细胞株HCT116和LS174T,观察结直肠癌细胞与转移靶器官血管内皮细胞相互作用后的效应。对照肿瘤细胞有：前列腺癌PC3(转移靶器官为骨)、乳腺癌HCC1937细胞(转移靶器官肺/肝)、子宫内膜癌RL95-2细胞(转移靶器官为肺)；对照内皮细胞为脐静脉内皮细胞(HUVEC)。通过建立鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型、Matrigel三维培养模型、肿瘤细胞羊膜基底膜侵袭模型等,利用HE染色、免疫组化、免疫荧光等实验方法,观察结直肠癌细胞与HHSEC、HUVEC相互作用对血管生成及肿瘤浸润的影响。方法1.细胞培养人结肠癌肿瘤细胞株包括SCP17、SCP40、HCT116、LS174T,人乳腺癌细胞株HCC1937,人前列腺癌细胞株PC3,人肝窦内皮细胞]HHSEC采用含10%胎牛血清的RPMI1640培养。人子宫内膜癌细胞株RL95-2,脐静脉内皮细胞HUVEC采用含10%DMEM F-12培养。在37℃、5%C02、饱和湿度下传代培养。细胞生长状态良好时用于实验。2.建立鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型选取7日龄活鸡胚,6×106个结直肠癌肿瘤细胞SCP17细胞与3×106个HHSEC、3×106个HUVEC细胞悬液分别接种于鸡胚绒毛尿囊膜,72h后观察鸡胚绒毛尿囊膜血管生成情况。3.Matrigel基质胶三维培养观察结直肠癌细胞与HHSEC对血管拟态发生的影响(1)构建稳定慢病毒载体LVCON145,使HHSEC、HUVEC稳定表达绿色荧光。(2) Matrigel基质胶三维共培养,观察肿瘤细胞与内皮细胞相互作用形成血管拟态。4.建立肿瘤细胞侵袭模型,观察靶器官内皮细胞HHSEC对结直肠癌肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。(1)肿瘤细胞与内皮细胞共培养动态可视化模型肿瘤细胞SCP17、SCP40、HCT116、LS174T、HCC1937、PC3、RL95-2分别与靶器官内皮细胞HHSEC、非靶器官内皮细胞HUVEC分层置于浓度为80%Matrigel基质胶共培养,观察肿瘤细胞和内皮细胞的趋化方向及迁移能力的变化情况。(2)建立羊膜基底膜肿瘤细胞侵袭模型a)取剖宫产后无菌胎盘羊膜制备羊膜基底膜,模拟肿瘤侵袭转移过程中的生物基底膜。b)肿瘤细胞SCP17、SCP40、HCT116、LS174T、HCC1937、PC3、RL95-2分别与靶器官内皮细胞HHSEC、非靶器官内皮细胞HUVEC于羊膜基底膜上共培养,4%甲醛液固定4-12h,HE染色。根据肿瘤细胞浸润深度,评估肿瘤细胞的侵袭状态。5.统计学分析用SPSS13.0软件进行数据分析,同一肿瘤细胞实验组和对照组比较用独立样本T检验(Independent-Samples T Test)。各肿瘤细胞间的比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA),两两比较采用Bonferroni法,多因素之间比较用析因方差分析(Univariate analysis of variance)。结果1.鸡胚尿绒毛囊膜血管生成模型7日龄鸡胚尿囊膜上,种植6×106SCP17细胞悬液。72h后,鸡胚尿囊膜上血管生成较未种植肿瘤细胞的鸡胚尿囊膜明显增多。6×106SCP17分别与3×106靶器官内皮细胞HHSEC及非靶器官内皮细胞HUVEC混合种于7日龄鸡胚尿囊膜,72h后,鸡胚尿囊膜血管增生增强,且靶器官内皮细胞HHSEC组血管增生更强。而鸡胚尿囊膜种植肿瘤细胞和HUVEC混悬液仅在13天后偶见肿瘤形成。在肿瘤组织内形成的血管内可见有核红细胞,肿瘤内皮细胞由鸡胚内皮细胞构成。2.Matrigel基质胶三维培养观察结直肠癌肿瘤细胞与靶器官内皮细胞HHSEC对血管拟态发生的影响(1) Matrigel基质胶三维培养肿瘤细胞或内皮细胞,未见明显血管拟态生成。(2)肿瘤细胞与内皮细胞Matrigel基质胶三维共培养,可见血管拟态的发生。结直肠癌肿瘤细胞与靶器官肝窦内皮细胞HHSEC Matrigel基质胶三维共培养7天后,SCP40较SCP17血管拟态生成增多,HCT116较LS174T血管拟态生成增多(P<0.001)；而不以肝脏为转移靶器官的肿瘤细胞中,HCC1937、RL95-2无明显血管拟态生成,PC3血管拟态生成较与HUVEC共培养后增多(P<0.001)。与非靶器官内皮细胞]HUVEC Matrigel基质胶三维共培养7天后,SCP40较SCP17血管拟态生成减少,HCT116较LS174T血管拟态生成减少(P<0.001)；而不以肝脏为转移靶器官的肿瘤细胞,HCC1937、RL95-2可见血管拟态生成,而PC3血管拟态生成较与HHSEC共培养后生成减少(P<0.001)。3.建立肿瘤细胞侵袭模型,观察靶器官内皮细胞HHSEC对结直肠癌肿瘤细胞浸润转移能力的影响(1)肿瘤细胞与内皮细胞动态可视化模型将肿瘤细胞、内皮细胞分层置于Matrigel基质胶共培养3-5天,可见部分肿瘤细胞突破“界线”,进入非肿瘤细胞层基质胶中。但未找能观察到肿瘤细胞趋化方向,亦未能明确在内皮细胞的影响下肿瘤细胞的迁移轨迹及迁移能力的变化。(2)建立羊膜基底膜肿瘤细胞侵袭模型,根据不同肿瘤细胞的浸润侵袭能力,评估靶器官内皮细胞对肿瘤细胞侵袭能力的影响。a)不同肿瘤细胞羊膜基底膜侵袭的能力不一致,HCC1937>PC3>SCP40/LS174T>SCP17/HCT116>RL95-2(P<0.001).b)结直肠癌肿瘤细胞与靶器官内皮细胞HHSEC共培养4-5天后,行HE染色,SCP17羊膜基底膜浸润能力强于SCP40,HCT116强于LS174T(P<0.001)。而不以肝脏为转移靶器官的肿瘤细胞中,HCC1937+HHSEC组羊膜基底膜浸润能力弱于空白组(P<0.001),PC3+HHSEC组羊膜基底膜浸润能力强于空白组(P<0.001),RL95-2+HHSEC组羊膜基底膜浸润能力增于空白组(P=0.001)。与非靶器官内皮细胞HUVEC共培养4-5天后,SCP40羊膜基底膜浸润能力强于SCP17,HCT116强于LS174T(P<0.001);而不以肝脏为转移靶器官器官的肿瘤细胞中,PC3+HUVEC.RL95-2+HUVEC羊膜基底膜浸润能力均强于相应空白组(P<0.001),HCC1937+HUVEC羊膜基底膜浸润能力弱于空白组(P<0.001)。结论1.靶器官内皮细胞能够促进低转移能力结肠癌细胞形成血管拟态,促进肿瘤血管发生,提示靶器官内皮细胞促进肿瘤细胞的侵袭和转移。2.内皮细胞影响肿瘤细胞的迁移能力,在内皮细胞的作用下,肿瘤细胞的迁移能力增强,而靶器官内皮细胞HHSEC对结直肠癌细胞的迁移促进作用比非靶器官内皮细胞(脐静脉内皮细胞HUVEC)更明显。3.内皮细胞增强了肿瘤转移过程中血管拟态的发生,靶器官内皮细胞HHSEC、脐静脉内皮细胞HUVEC对结直肠癌细胞转移过程中血管拟态的发生起积极促进作用。4.内皮细胞增强了肿瘤的侵袭能力,靶器官内皮细胞HHSEC对结直肠癌的侵袭转移有正向促进作用。本研究的创新之处1.比较不同肿瘤细胞在靶器官内皮细胞和非靶器官内皮细胞作用下的迁移能力及侵袭能力。2.建立Matrigel基质胶三维培养模型,动态观察肿瘤转移过程的血管拟态,观察靶器官血管内皮促进血管发生的效应机制。