论文部分内容阅读
目的: 肿瘤已成为危及全人类生命的重大疾病，其中非小细胞肺癌(Non-small celllung cancer，NSCLC)是目前发病率与死亡率最高的恶性肿瘤之一。在肿瘤基因治疗领域，运用病毒治疗肿瘤的溶瘤病毒治疗(Oncolytic virotherapy)备受瞩目。其中溶瘤麻疹病毒疫苗株(MV-Edm)因其可靠的安全性和良好的溶瘤效果已经进入几项临床试验。明确调控MV-Edm瘤内复制及其溶瘤的相关机制对于有效促进病毒复制并提高其溶瘤效果非常关键。本研究首次探讨MV-Edm在NSCLC中，是如何通过诱导细胞线粒体自噬来调控抗病毒固有免疫和凋亡信号通路，以促进病毒的复制，并最终导致NSCLC坏死性细胞死亡的溶瘤新机制。同时，在阐明这些新的调控机制的基础上，提出优化MV-Edm溶瘤治疗的新策略。 方法: 1.细胞自噬的检测:1)将eGFP-LC3质粒分别转染A549和H1299细胞后感染MV-Edm，然后通过激光共聚焦显微镜观察细胞内eGFP-LC3的分布情况;2）单独感染MV-Edm或与氯喹(Chloroquine，CQ)共处理细胞，通过westernblot方法检测LC-3Ⅱ和SQSTM1蛋白的表达情况。 2.线粒体自噬的检测:1）将eGFP-LC3质粒转染细胞后感染MV-Edm，使用线粒体红色荧光探针(MitoTracker Red)标记细胞内线粒体，最后通过激光共聚焦显微镜观察细胞内线粒体与自噬体是否发生共定位;2）用透射电子显微镜观察MV-Edm感染的细胞内是否存在包裹线粒体的双层膜结构;3）MV-Edm感染细胞后，用线粒体绿色荧光探针(MitoTracker Green)标记细胞内线粒体，通过流式细胞仪检测分析细胞内线粒体数量;4）用MV-Edm感染细胞后，通过western blot方法检测线粒体蛋白——热休克蛋白60(Heatshock protein60，HSP60)的含量。 3.细胞自噬调控固有免疫和凋亡信号通路的检测:在NSCLCs中，利用siRNA介导的基因沉默技术抑制自噬关键靶分子（ATG7、BECN1、SQSTM1以及RAB7）的表达和质粒介导的基因过表达技术上调自噬关键靶分子（ATG5K130R和ATG5），然后感染MV-Edm，检测细胞内病毒的复制、Ⅰ型干扰素等抗病毒免疫分子表达、DDX58/IFIH1/MAVS通路相关分子的表达、细胞凋亡的特征性变化、Cyto-Cytochrome C、caspase-9、caspase-3、cleaved-PARP蛋白的表达、细胞内损伤线粒体数量的变化等，以明确MV-Edm诱导的自噬对病毒复制的影响以及与凋亡的相互调控关系。 4.MV-Edm溶瘤机制的检测:1）用泛caspase抑制剂(z-VAD-fmk)，程序性坏死特异性抑制剂(Necrostatin-1)或ROS抑制剂NAC分别预处理NSCLCs，然后感染MV-Edm，通过台盼蓝计数的方法检测细胞活度;2）用不同MOI的MV-Edm感染NSCLCs，检测细胞活度，LC3-Ⅱ及SQSTM1的表达，分析其相关性;3）用MV-Edm感染NSCLCs，通过western blot方法检测caspase-3、cleaved-PARP水平;4）用MV-Edm感染NSCLCs，检测胞外HMGB1蛋白的表达，细胞内ATP含量，病毒的复制动态水平，分析其相关性;5）用流式细胞仪检测细胞内ROS水平。 结果: 1.MV-Edm感染NSCLCs可以诱导具有完整功能的细胞自噬，表现为外源转染的LC3发生点状聚集、LC3蛋白发生型别转换即被脂质化、自噬受体蛋白SQSTM1随感染时间的延长减少和溶酶体自噬降解LC3-Ⅱ的过程被氯喹抑制。 2.MV-Edm感染NSCLCs诱导线粒体自噬:MV-Edm感染促进细胞内线粒体与自噬体发生共定位;MV-Edm感染的细胞内能观察到大量包裹线粒体的双层膜结构;MV-Edm感染的细胞内线粒体数量随时间延长显著减少;MV-Edm感染的细胞内，线粒体标志蛋白HSP60的含量显著降低。 3.抑制细胞自噬后，细胞内病毒的复制降低，Ⅰ型干扰素等抗病毒免疫分子表达增加，DDX58/IFIH1/MAVS通路相关分子的表达增加;细胞内损伤线粒体数量增加，同时Cyto-Cytochrome C、caspase-9、caspase-3、cleaved-PARP凋亡相关蛋白的表达增加，凋亡细胞数量增加。 4.MV-Edm诱导SQSTM1介导的线粒体自噬，一方面导致定位在线粒体外膜上的MAVS减少，减弱细胞内抗病毒固有免疫应答;另一方面降解损伤线粒体抑制损伤线粒体内细胞色素C的释放，抑制细胞凋亡通路激活，同时促进MV-Edm的复制。 5.MV-Edm的复制与诱导持续的细胞自噬最终导致胞内ATP的耗竭，引起NSCLCs坏死性死亡。 结论: 1.MV-Edm通过诱导线粒体自噬来抑制细胞的抗病毒固有免疫应答，这个新发现揭示了MV-Edm抵御细胞抗病毒免疫的新机制。 2.MV-Edm通过诱导线粒体自噬抑制细胞凋亡，促进病毒的复制，导致NSCLC坏死性细胞死亡，阐述了以前尚未明确的新的溶瘤机制。 3.意义:这些新发现的溶瘤机制和调控抗病毒免疫的机制，为通过调节自噬增强MV-Edm溶瘤效果的进一步研究提供了新思路，为优化MV-Edm溶瘤策略提供新的理论依据和可行方法，同时也为抗病毒治疗提供借鉴。