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结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,在我国发病率逐年上升。手术依然是治疗结肠癌最有效的方法,尽管如此,仍有部分病人最终死于复发或转移。如能有效利用人体自身的免疫系统,发挥其对肿瘤组织的特异性杀伤作用,有可能使肿瘤治疗迈上新的台阶。iNKT(invariant natural killer T,iNKT)细胞为一类具有NK细胞和T细胞特性的免疫细胞,通过其表面的TCR受体识别由CDld分子提呈的糖脂类物质(a-Galcer)进而活化,分泌大量细胞因子调节下游树突细胞(dendritic cells, DCs)、NK细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞等,在连接固有免疫和适应性免疫中发挥关键作用。有研究加载α-Galcer至肿瘤细胞形成肿瘤细胞/a-Galcer复合物(?)umor/α-Galcer)通过静脉注射免疫小鼠,可以诱导部分抗肿瘤免疫反应。探究其原理,tumor/α-Galcer进入体内后,首先被iNKT细胞识别并使其活化,活化后的iNKT细胞一方面对肿瘤进行杀伤并提供肿瘤抗原；另一方面经由CD40-CD40L通路激活DCs;最终,成熟的DCs可以诱导特异性肿瘤免疫反应,(?)DCs作为最重要的抗原提呈细胞,是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。前期试验中,我们利用toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)的配体在体外可以有效激活DCs,并诱导针对肿瘤的特异性杀伤。然而以此制备的肿瘤疫苗在治疗小鼠结肠癌时并未显示出很好的疗效。分析原因,可能有以下几点：1.通过体外直接加载肿瘤抗原至DCs时,抗原提呈的效率较低,不足以诱导强大的体内抗肿瘤免疫反应；2.体外荷载的抗原为单一表位,肿瘤细胞通过下调上述抗原表位导致免疫逃逸；3.荷瘤小鼠体内存在多种免疫抑制细胞,如调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)、髓源性抑制细胞(Myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)等,阻碍正常抗肿瘤免疫应答的产生。结合我们的前期工作以及大量文献研究,单一免疫细胞治疗可能不足以诱导有效的抗肿瘤免疫反应,而通过激活体内多种免疫细胞,发挥其免疫协同作用,不但有希望诱导有效的细胞免疫和体液免疫,并且有可能扭转肿瘤微环境中的免疫抑制因素,从而获得有效且持久的抗肿瘤免疫反应。因此,为进一步增强抗肿瘤免疫反应,本课题我们利用肿瘤细胞/α-Galcer复合物联合TLR9配体(CpG1826)制备新型肿瘤疫苗,通过协同iNKT和DCs以诱导有效的细胞免疫和体液免疫,从而达到有效的抗肿瘤免疫效果,为遏制肿瘤转移、复发提供新思路。目的：构建肿瘤疫苗(tumor/a-Galcer+TLR9配体),探讨疫苗对机体免疫功能的影响并验证肿瘤疫苗对小鼠结肠癌的治疗效果,通过以上研究为构建新型肿瘤疫苗提供研究思路。方法：运用慢病毒转染GFP-FLAG-CD1d至MC38肿瘤细胞构建CDld-MC38细胞系,并验证上述CDld-MC38细胞与a-Galcer的结合效率,最后制备CD1d-MC38/a-Galcer复合物。将C57BL/6小鼠分为五组,分别尾静脉注射PBS、a-Galcer、CpG1826、CD1d-MC38/a-GC和CD1d-MC38/a-GC+CpG1826:(1)利用流式细胞术检测肝脏NKT细胞表面CD69和CD40L表达水平；采用流式胞内染色法检测NKT、NKT细胞IFN-γ分泌情况：(2)利用流式细胞术检测脾脏中DC表面共刺激分子(MHC-Ⅱ, CD40, CD80, CD86)的表达水平,应用流式细胞术和ELISE检测DC分泌IL-12的水平;(3)不同时间点收集各组小鼠血清,利用CBA技术检测Th1/Th2型细胞因子分泌情况。最后建立小鼠MC38结肠癌皮下肿瘤模型,观察小鼠肿瘤生长速度和存活时间,验证CD1d-MC38/a-GC+CpG1826对于小鼠肿瘤的治疗作用,最后用免疫组化检测肿瘤组织中CD4+T和CD8+T细胞浸润情况。结果：1.成功构建表达CD1d和GFP的小鼠MC38结肠癌细胞系；CDld-MC38细胞系能有效结合α-Galcer。(1)CD1d蛋白表达水平的检测结果：Western blot显示,CDld-MC38具有明显的FLAG标签蛋白表达,而MC38细胞无标签蛋白表达,表明CD1d转染成功；流式细胞术结果提示,CD1d阳性的CD1d-MC38细胞比例为(98.10±2.53)%,MC38细胞CDld阳性率为(0.38±0.012)%,两组间存在明显统计学差异(P<0.001)：(2)CD1d-MC3与α-Galcer结合效率的检测结果：随着α-GC浓度和加载时间的递增,CD1d:α-GC结合率也逐渐上升,提示结合效率具有明显的浓度和时问依赖性。尽管1ug/ml α-GC加载60h,结合效率为(87.68±9.74)%,与其余各组均有统计学差异(P<0.01)。考虑到细胞培养时间60h状态欠佳,我们选取1ug/ml α-GC加载48h来制备CD1d-MC38/a-GC复合物,此时结合效率为(74.36±6.68)%,与1ug/ml α-GC加载36h组(66.54±5.48)%相比具有统计学意义(P<0.05),与500ng/ml a-GC加载48h组(38.54±6.87)%也有统计学差异(P<0.01)。2. CDld-MC38/a-GC+CpG1826肿瘤疫苗在体内能有效激活NKT、NK细胞以及DCs。(1)iNKT、NK细胞的活化情况：实验组CD69+iNKT细胞明显升高,阳性细胞比例为(34.68±4.75)%,与a-Galcer组相比有统计学差异(P<0.05),与其余各组相比具有明显统计学差异(P<0.01)；实验组iNKT细胞CD40L表达率明显升高,阳性细胞比例为(41.84±7.98)%,与各组均有明显统计学差异(P<0.01)；实验组IFN-γ+iNKT细胞比例为(39.34±6.38)%,与a-Galcer组无统计学差异(P>0.05),与其余各组存在明显统计学差异(P<0.01)；实验组IFN-γ+iNK细胞比例为(46.49±5.29)%,与a-Galcer组无统计学差异(P>0.05),与其余各组存在明显统计学差异(P<0.01)。(2)DC细胞成熟情况：DCs细胞表面分子表达水平检测：实验组MHC+DCs和CD86+DCs比例分别为(82.4±6.83)%和(85.9±8.32)%,与a-Galcer组无统计学差异(P>0.05),与其余各组存在明显统计学差异(P<0.01)；而CD40+DCs比例为(69.2±5.62)%,与各组具有明显统计学差异(P<0.01)。DCs分泌IL-12能力检测：流式细胞术结果显示,实验组DCs分泌IL-12能力明显增强,其中IL-12+细胞比例为(26.9±3.56)%,与其余各组相比均有明显统计学差异；ELISA结果显示,实验组DCs培养上清中IL-12浓度最高,为(386.4±27.9pg/m1),与其余各组均有明显统计学差异(P<0.01)。3.CD1d-MC38/α-GC+CpG1826可以促进小鼠体内Thl细胞因子的分泌,降低Th2细胞因子的分泌水平。实验组小鼠的血清IL-2浓度明显升高,在2h时浓度到达高峰,之后逐渐下降。在2h时小于a-GC组(P<0.01),高于其余各组(P<0.01),均有明显统计学差异；实验组血清TNF-a浓度在各个时间点均为最高,与各组每个时间点均有明显统计学差异(P<0.01)；实验组血清IFN-γ浓度2h,6h逐渐上升,10h时达到高峰,之后逐渐下降。实验组与a-GC组在各个时间点均无统计学差异(P>0.05),而两组在每个时间点都大于其余各组,有明显统计学差异(P<0.01)；实验组血清IL-4浓度在2h,6h时小于a-GC组和CD1d-MC38/α-GC组,有统计学差异(P<0.01),与CpG1826组相比无统计学差异(P>0.05)；实验组血清IL-5浓度均小于a-GC组(P<0.01),大于PBS组(P<0.01),而与其余三组无统计学差异(P>0.05)。4.CDld-MC38/α-GC+CpG1826治疗小鼠结肠癌的体内实验显示：实验组小鼠肿瘤的平均体积明显小于其余各组(P<0.01)；其存活时间与CDld-MC38/α-GC组无统计学差异(P>0.05),与其余各组均有明显统计学差异(P<0.01)；肿瘤组织免疫组化显示,实验组肿瘤组织中有更多的CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润,与CDld-MC38/α-GC组无统计学差异(P>0.05),与其余各组均有明显统计学差异(P<0.01)。结论1.加载糖脂类的肿瘤细胞联合TLR9配体制备的肿瘤疫苗能有效激活iNKT细胞和促进DC成熟。2.上述肿瘤疫苗能促进血清中Th1型细胞因子(IL-2、TNF-α和IFN-γ)分泌,抑制Th2型细胞因子(IL-4,IL-5)分泌。3.上述肿瘤疫苗能抑制小鼠肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期,发挥抗肿瘤作用依赖于CD4+T细胞和CD8+T细胞。