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目的分析MAGE-D4 mRNA和蛋白在胶质瘤以及其他类型肿瘤组织中的表达情况,探讨血清MAGE-D4自身抗体出现的意义,初步了解MAGE-D4在肿瘤发生发展中的作用,为评价其用于肿瘤的辅助诊断和靶向治疗的可能性提供依据。方法1.采用生物信息学方法对MAGE-D4蛋白的同源性、理化性质、跨膜区域、二级结构、结构域、功能性位点、亚细胞定位及抗原表位进行分析和预测。2.采用RT-PCR方法获得MAGE-D4a全长编码区cDNA,构建MAGE-D4原核重组质粒,经测序正确后转化至Rosetta(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导融合蛋白的表达,表达的重组蛋白用Amylose Resin亲和层析分离纯化并进行质谱鉴定。3.用MAGE-D4融合蛋白免疫家兔,分离纯化抗血清;获得的抗血清分别用间接ELISA和Western Blot检测其效价和特异性。4.用RT-PCR和免疫组织化学技术,从mRNA和蛋白水平了解MAGE-D4基因表达的特点,并对其与肿瘤临床病理参数之间的关系进行初步分析。5.用重组MAGE-D4融合蛋白的间接ELISA法,检测胶质瘤等6种肿瘤及正常人血清中抗MAGE-D4抗体的阳性率,初步分析抗体出现的意义。结果1.生物信息学分析结果显示,MAGE-D4是一种不稳定的弱酸性可溶蛋白,无跨膜螺旋,无信号肽;二级结构以α螺旋(59.6%)和无规卷曲(23.8%)为主,在第334-368、450-480氨基酸位置处存在2个卷曲螺旋区域;最邻近距离法预测MAGE-D4蛋白定位于细胞核(55.5%);MAGE-D4蛋白序列中含有MAGE家族的保守结构域,含有N-糖基化位点、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶、酪氨酸激酶、酪蛋白激酶Ⅱ、蛋白激酶C等磷酸化修饰位点以及多种功能性基序,提示其在细胞生长、黏附及信号传导方面具有潜在功能;MAGE-D4蛋白可能存在多种HLA-A2限制性T细胞表位。2.获得了MAGE-D4的原核表达质粒,通过优化体外培养条件,融合蛋白的表达量可达到菌体总蛋白的47.7%,并且部分以可溶形式存在,亲和层析后得到纯度较高的融合蛋白,经质谱鉴定确定与目的蛋白相符。3.制备的MAGE-D4多克隆抗体纯化后的效价大于1﹕64000,能与MAGE-D4融合蛋白特异性识别并结合。4.在各种肿瘤组织中MAGE-D4 mRNA的表达率分别为:胶质瘤85.48%(53/62)、脑膜瘤76.92%(20/26)、肝癌71.70%(38/53)、结直肠癌81.03%(47/58);肝癌及结直肠癌癌旁组织中MAGE-D4表达频率低于相应的癌组织(P<0.05),分别为50.94%(27/53)及41.38%(24/58)。在所检测的11株肿瘤细胞中,肝癌、鼻咽癌、舌癌、卵巢癌等肿瘤细胞中表达MAGE-D4,而胃癌、结肠癌、乳腺癌等肿瘤细胞中不表达。免疫组织化学结果显示,MAGE-D4蛋白主要定位在胞浆;胶质瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、胃癌和结肠癌组织中MAGE-D4蛋白的阳性率分别为77.8%(21/27)、69.6%(16/23)、66.7%(2/3)、50%(1/2)和100%(2/2);3例正常脑组织和27例肺癌癌旁组织均未检测到MAGE-D4蛋白的表达。统计学分析显示胶质瘤及非小细胞肺癌中MAGE-D4蛋白表达与临床病理参数之间无显著性关联。5.肿瘤病人血清中MAGE-D4抗体的总阳性率为19.34%(47/243),其中肝癌为29%(10/35),肺癌为27%(8/30),结直肠癌为19%(12/64),胶质瘤为18%(9/51),胃癌为17%(5/30),脑膜瘤为9%(3/33);72例正常人血清中未检出MAGE-D4抗体。结论MAGE-D4在肿瘤组织中具有较高的表达频率,而在癌旁组织和正常组织中表达频率较低或不表达,提示它可能是一种肿瘤相关抗原基因。MAGE-D4在多种类型的肿瘤患者体内能引起体液免疫反应,有望成为肿瘤辅助诊断和免疫治疗的分子标记物。