研究背景：p-肾上腺素受体阻滞剂(p-受体阻滞剂)自1960年代以来广泛应用于以心血管疾病为主的临床医学各领域。在眼科方面,其家族中噻吗心安等亦普遍应用于青光眼疾病的治疗。近年来,非选择性p-受体阻滞剂普萘洛尔被证实对血管内皮细胞具有明显的抑制作用,并且可以进一步下调VEGF、bFGF等与血管瘤生成密切相关的血管生成因子,因此在血管瘤的临床治疗方面获得了有效地推广,有望取代传统的治疗方法成为一线药物。随后,有报道将普萘洛尔抑制新生血管以治疗血管瘤的作用运用于小鼠高氧诱导早产儿视网膜病变模型中新生血管的治疗,亦达到了一定的抑制作用。正常角膜无血管、无淋巴管的特性,是维持其透明度及免疫赦免的必要条件。当感染、外伤、免疫反应等病理因素破坏这一无血管的平衡状态时,新生血管便会从角膜缘血管网侵入角膜,破坏角膜微环境,导致其正常结构和功能的受损,严重情况下甚至造成视功能丧失。角膜新生血管作为最常见的致盲原因之一,及角膜移植术后发生排斥反应的高危因素,一直是眼科研究领域所面临的最重要的问题之一。前述研究均与角膜新生血管的治疗研究有共同的理论基础。目前,国内外尚无普萘洛尔针对角膜新生血管疾病模型治疗作用的研究。角膜新生血管的动物模型是研究新生血管调控机制,探索和评价其防治方法的重要手段。小鼠角膜碱烧伤模型作为经典模型之一,能够逼真地再现角膜碱烧伤的病理状态,是研究炎症性新生血管发生机制和治疗的重要手段。由于该模型成本不高,便与标准化操作及重复性好等优点,得到广泛应用。角膜新生血管的出现依赖于机体产生的各种促血管生长及抑制血管生长的因子--包括炎症因子、生长因子、各种酶类等,互相调节形成的复杂网络。对这一网络各环节的大量研究为寻找新生血管治疗靶点提供了有效依据。VEGF是目前发现的最强的促血管生成因子,与生理性血管生成和病理性新生血管形成密切相关。VEGF能够角膜新生血管形成过程中增强内皮细胞的增殖与迁移、参与血管基底膜的降解和增加血管渗透性。bFGF属于成纤维细胞生长因子家族,能刺激细胞有丝分裂,诱导新生血管生成,在机体的血管生成、神经系统生长发育及创伤愈后过程中都起着十分重要的作用。IGF-1是一种既有胰岛素样合成代谢作用,又有促生长作用的多肽生长因子,几乎存在于机体所有组织中,同样可以促进新生血管的形成。在血管瘤的病理演变过程中,VEGF和bFGF是最密切相关的促血管生长因子,当对普萘洛尔抑制血管瘤的机制进行研究时,VEGF和bFGF的表达出现明显下调,加速血管瘤的退化；而在普萘洛尔抑制小鼠缺氧诱导早产儿视网膜病变模型中新生血管的研究中,VEGF和IGF-1通过各自的通路下调表达水平,进而达到减轻新生血管的治疗目的。第一部分普萘洛尔对体外培养小鼠角膜上皮细胞,小鼠角膜基质成纤维细胞和人脐静脉血管内皮细胞的作用目的：通过体外实验,初步确定普萘洛尔对参与CNV生发的三种主要细胞—小鼠角膜上皮细胞(MCEC)、小鼠角膜基质成纤维细胞(MCSFC)和人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)--的毒性作用,为下一步的实验和临床研究奠定理论依据。方法：1.健康成年(9-11周龄)清洁级Balb/c小鼠6只,取新鲜角膜进行小鼠角膜上皮细胞、小鼠角膜基质成纤维细胞；取新鲜离体人脐带,进行人脐静脉血管内皮细胞的体外培养。CD31免疫荧光染色鉴定P3代HUVEC。2.取P1代MCEC和MCSFC, P3代HUVEC,通过MTT比色法检测普萘洛尔对前述三种细胞半量抑制浓度(IC50)值。各组细胞分别加入100μ1／孔新鲜配制盐酸普萘洛尔梯度浓度培养基,按序10-1-10-8M,重复三次。培养24Hr后,加入MTT溶液(5mg/ml)20μl/孔酶标仪在570nmm波长处检测OD值,并换算相应Mean(细胞死亡率%),通过4PL Curve Analysis确定IC50值(M)3.取P1代MCEC和MCSFC, P3代HUVEC,通过7AAD染色经流式细胞仪检测普萘洛尔对前述三种细胞存活率的影响。各组细胞分别加入含130μg盐酸普萘洛尔的新鲜培养基5ml(普萘洛尔终浓度10-4M),培养24Hr,取106细胞+100μl7AAD (200μg/ml)+1ml PBS均匀混合于流式细胞仪下进行活细胞分选,GraphPad Prism软件分析。结果：1.P1代小鼠角膜上皮细胞贴壁生长,单层融合,细胞较大,呈典型的多角形铺路石状形态；P1代小鼠角膜基质成纤维细胞贴壁生长,单层融合,细胞边界清楚,胞浆丰富,呈梭形规整排列；P3代人脐静脉血管内皮细胞贴壁生长,单层融合,细胞边界清楚呈多角形、圆形或椭圆形,胞浆丰富,排列规整。2.荧光倒置显微镜下见,所测P3代HUVEC的CD31-GFP荧光阳性反应率>95%,证明所培养的细胞是人脐静脉血管内皮细胞。3.IC50值：MCEC为10-3,165M,MCSFC为10-3,955M,HUVEC为10-4.866M。说明体外培养时,普萘洛尔诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的能力高于对小鼠角膜上皮和基质细胞的诱导能力。4.在含10-4M普萘洛尔的培养基中,MCEC和MCSFC的存活率不受普萘洛尔影响,而HUVEC的存活率有明显降低。结论：普萘洛尔的半数抑制浓度在三种细胞培养中表现为：HUVEC <MCSFC<MCEC。在使用同一浓度(104M)的情况下,角膜新生血管形成过程中主要细胞成分对普萘洛尔具有不同反应,HUVEC对普萘洛尔药物毒性的耐受度低于MCEC和MCSFC.说明在不影响上皮细胞与基质细胞修复的情况下,血管内皮细胞的死亡可以降低角膜新生血管的发生率或促进角膜新生血管的消退,为减少CNV在损伤修复过程中的有害作用提供了体外实验依据。第二部分普萘洛尔对小鼠角膜碱烧伤模型中新生血管的抑制作用目的：建立可靠有效的小鼠角膜碱烧伤模型,通过体内实验,观察炎症相关性CNV的增殖过程,及不同时期角膜样本的组织病理学变化；比较口服及腹腔内注射两种不同给药途径下普萘洛尔对CNV的抑制作用；并与无外界其他干扰因素下的碱烧伤正常病理过程进行对照,为进一步证实普萘洛尔对CNV的抑制作用寻找治疗依据。方法：1.200只Balb/c小鼠建立左眼角膜碱烧伤模型(滤纸片直径2mm,0.5mol/L NaOH溶液,烧灼20s)。随机将角膜碱烧伤3日后Balb/c小鼠平均分为3组,分别为生理盐水对照组(对照/Control组),予腹腔注射生理盐水0.5ml；腹腔内普萘洛尔给药组(腹腔注射/IP组),予0.04%盐酸普萘洛尔溶液0.5m1；及灌胃普萘洛尔给药组(口服/PO组),予0.04%盐酸普萘洛尔溶液0.5m1。三组分别在建模成功后第4、5、6日给予处理,2次/日。2.记录裂隙灯下建模成功后3D、7D、10D、14D小鼠眼前节情况,进行分析,并对角膜炎症积分计算(包括新生血管评分、角膜水肿评分和眼内渗出或出血评分)。3.于建模后3D和各组7D、10D、14D,随机取5只小鼠/组,行角膜H&E染色组织病理学检查。4.于建模后3D和各组7D、10D、14D,随机取5只小鼠/组,行角膜免疫组织化学CD31表达检查,并于共聚焦显微镜下拍照,Image J图像处理系统分析CNV生长指数。结果：1.裂隙灯大体观察记录显示,在建模后3D-14D的病理过程中,角膜新生血管长度、水肿程度、眼内出血及渗出情况均表现为：IP组程度最轻,消退速度最快;PO组其次；对照组最重且最慢。2.角膜炎症积分的变化趋势显示,对照组的样本炎症情况在3D到10D(2.92±0.51至4.33±0.49)过程中随时间增加处于上升趋势并达到顶峰,至14D(2.17±0.72)炎症好转；腹腔注射组的样本炎症情况表现为3D高于7D(2.92±0.51至2.25±0.45),至10D(2.42±0.51)保持稳定,无明显变化,14D(1.08±0.29)时明显下降；PO组的样本炎症情况在3D到7D(2.92±0.51至3.25±0.75)过程中随时间增加处于上升趋势并达到顶峰,至10D(3.17±0.58)呈现稳定,14D(1.33±0.49)明显好转。说明炎症量化结果为：IP组最轻及持续时间最短,PO组其次,对照组最重及持续时间最长。3.H&E组织病理学检查结果与炎症大体观察变化趋势基本一致,在新生血管生长方面,基质水肿程度、炎症细胞浸润及上皮愈合情况各方面,均为IP组最轻及持续时间最短,PO组其次,对照组最重及持续时间最长。4.CNV生长面积(%)比较可知,对照组CNV面积增长在3D-10D(11.81±1.210至35.47±1.780)这一过程中与炎症变化一致,14D(34.22±2.430)时相比10D保持稳定；IP组CNV生长面积在3D-7D(11.81±1.210至12.76±2.110)保持稳定,自10D(10.19±2.395)起随时间增加处于大幅下降趋势,至14D(5.840±1.320)并且明显低于3D时水平；；PO组CNV生长面积在3D-10D(11.81±1.210至27.69±1.930)过程中随时间增加处于上升趋势并达到顶峰,14D(20.33±1.050)明显下降。三组变化趋势与前述结果基本一致,为IP组CNV程度最轻,消退速度最快；PO组其次；对照组最重且最慢。结论：使用0.5mol/L NaOH浸泡滤纸片在角膜中央直径2mm区域内烧灼20s的优化方式建立Balb/c小鼠角膜碱烧伤模型,可以成功诱导出炎症性角膜新生血管,在评价普萘洛尔对CNV抑制作用的同时,局限了炎症的发展,避免多重因素的干扰作用,最大限度的提高了模型的利用率,清晰地呈现普萘洛尔在各组中不同的治疗作用。当CNV出现后,将0.04%的普萘洛尔按0.5m1/只,一日两次,连续三日的剂量应用在这一模型上时,可以显著抑制CNV的生长,减少新生血管面积,并且控制炎症的发展,既发挥了新生血管在角膜修复过程中增加微循环以促进代谢的积极作用,又降低了炎症和新生血管互相刺激对修复产生的不利影响,最终加速了角膜的修复,使CNV提前进入了消退期。由于普萘洛尔脂溶性影响了口服利用率,所以最终对CNV的抑制作用表现为IP组>PO组>对照组。第三部分普萘洛尔对小鼠角膜碱烧伤新生血管模型中VEGF、IGF-1和bFGF的表达影响目的：通过对VEGF、IGF-1和bFGF三种与普萘洛尔调节新生血管机制密切相关的促血管生长因子表达变化的检测,确定普萘洛尔抑制小鼠角膜碱烧伤模型中CNV时在基因和蛋白水平的产生的影响,为普萘洛尔抑制CNV的作用寻找更深入可靠的实验依据,也为CNV的药物治疗提供新的应用思路。方法：1.200只Balb/c小鼠建立左眼角膜碱烧伤模型(滤纸片直径2mm,0.5mol/L NaOH溶液,烧灼20s)。随机将角膜碱烧伤3日后Balb/c小鼠平均分为3组,分别为生理盐水对照组(对照/Control组),予腹腔注射生理盐水0.5m1；腹腔内普萘洛尔给药组(腹腔注射/IP组),予0.04%盐酸普萘洛尔溶液0.5ml；及灌胃普萘洛尔给药组(口服/PO组),予0.04%盐酸普萘洛尔溶液0.5ml。三组分别在建模成功后第4、5、6日给予处理,2次/日。2.随机取建模后3D和各组7D、10D、14D小鼠各5只,逆转录PCR检测小鼠角膜VEGF、IGF-1、bFGF的基因表达率。电泳结果采用Image J图像分析软件进行灰度值分析,结果以VEGF、IGF-1、bFGF与内参GAPDH mRNA扩增产物的灰度相对比值进行统计学分析。3.随机取建模后3D和各组7D、10D、14D小鼠各5只,ELISA检测小鼠角膜VEGF、IGF-1、bFGF的蛋白表达量并进行统计学分析结果：1.由RT-PCR结果可知,VEGF基因表达率(%)为：对照组3D-10D(41.00±2.95至83.42±5.62)期间,VEGF随时间增加而增多,达到顶峰,14D(32.92±3.58)时明显回落,低于3D时水平；IP组3D和7D期间(41.00±2.95至41.42±3.94)保持稳定,随后随时间增加而明显下降,14D(4.50±2.28)时降幅极其显著；PO7D(55.50±4.78)时明显高于3D(41.00±2.95),7D-10D(57.58±5.60)期间保持稳定,14D(21.33±2.84)时出现显著降低。因此IP组VEGF基因表达率程度最轻,降低最快；PO组其次；对照组最重且最慢。2.由RT-PCR结果可知,IGF-1基因表达率(%)为：对照组,3D-7D(61.00±3.86至61.33±3.85)期间保持稳定,10D(72.33±3.55)出现增加,14D(59.75±2.93)时明显回落；腹腔注射组,3D-14D(61.00±3.86至37.17±3.04)期间随时间增加而明显下降；口服组,3D-10D(61.00±3.86至59.75±3.96)期间保持稳定,14D(47.42±2.99)时出现显著降低。由此可知,7D时IGF-1基因表达率在对照组和PO组间无明显变化,IP组明显低于前两组,而10D和14D时,基因表达率均为对照组>PO组>IP组。3.由RT-PCR结果可知,bFGF基因表达率(%)为：对照组中,7D(60.08±3.03)高于3D(55.83±2.72)时,10D(50.00±3.36)出现回落,10D-14D(49.17±2.37)期间保持稳定；IP组,3D-10D(55.83±2.72至45.17±3.38)期间随时间增加而明显下降,10D-14D(42.75±2.93)期间保持稳定；PO组,3D-7D(55.83±2.72至56.83±3.30)期间保持稳定,10D(48.00±3.30)时出现显著降低,10D-14D(46.58±4.68)期间保持稳定。由此可知,7D-14D各时间时bFGF基因表达率在对照组和PO组间均无明显变化,IP组明显低于前两组。4.由Elisa结果可知,VEGF蛋白表达量(pg/ml)为：对照组3D-10D(105.56±8.21至150.24±4.70)期间,VEGF随时间增加而增多,达到顶峰,14D(74.06±4.39)时明显回落,低于3D时水平；IP组7D(91.07±7.89)时较3D(105.56±8.21)时明显降低,其后随时间增加持续下降,降幅极其显著(至19.88±1.43)；PO组3D-7D(105.56±8.21至112.82±7.92)期间保持稳定,随后随时间增加而明显下降(至42.01±4.94)。各组蛋白水平变化趋势与基因水平基本一致,表现为IP组表达量最低,降低最快；PO组其次；对照组最高且最慢。5.由Elisa结果可知,IGF-1蛋白表达量(pg/ml)为：对照组,3D-7D(173.33±10.44至254.69±13.53)期间增长,10D(227.59±14.11)起出现下降,至14D(167.92±3.94)持续下降；腹腔注射组,3D-14D(173.33±10.44至82.90±4.45)期间随时间增加而明显下降；PO组,3D-7D(173.33±10.44至187.34±10.70)期间保持稳定,随后随时间增加而明显下降(至132.31±2.98)。各组蛋白水平变化趋势与基因水平基本一致。6.由Elisa结果可知,bFGF蛋白表达量(pg/ml)为：对照组3D-7D(140.67±3.69至177.78±3.29)期间增长,10D(162.61±6.48)起出现下降,至14D(131.27±4.33)持续下降；IP组3D-7D(140.67±3.69至140.48±7.04)期间保持稳定,随后随时间增加持续下降(至71.06±3.02)；PO组7D(153.36±3.90)时高于3D(140.67±3.69),10D(131.99±±5.38)出现显著降低10D-14D(至127.68±4.0)期间保持稳定。7D-10D各时间点均为对照组>口服组>腹腔注射组,14D时对照组和口服组间无明显变化,腹腔注射组明显低于前两组。各组蛋白水平变化趋势与基因水平基本一致,结论：普萘洛尔对CNV的抑制作用建立在对多种促血管生成因子共同调控的基础上,通过对炎症性CNV病理过程中这些因子不同程度的下调,达到抑制新生血管形成,促进其消退的目的,从微观层面印证了在前述小鼠模型中所得出的结论。我们在小鼠角膜碱烧伤模型中率先验证了普萘洛尔对新生血管的抑制作用,为后续相关研究提供了可靠有效的实验依据,同时结合普萘洛尔这种经典药物安全、便宜、疗效显著等优点,向CNV治疗的多元化发展提供了潜在的药物选择。