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研究背景和目的胃癌是世界范围内发病率最高同时也是致死率最高的恶性肿瘤之一,仅2012年,新诊断的胃癌患者就达到952000人:在我国其发病率及致死率在所有恶性肿瘤中更是首屈一指。从全球范围来看,近年来胃恶性肿瘤的发病率逐年降低,但是由于总人口数目的增多,人均寿命的增长及老年人的增多等不同原因,新的胃恶性肿瘤患者数目在不断增加。目前认为胃癌的发生是多种因素相互作用的结果,而癌基因的异常表达是其不可或缺的一部分,即与胃癌发生发展相关的原癌基因的异常高表达和/或抑癌基因的反常低表达甚至沉默是导致胃恶性肿瘤不断进展的重要致病因素,因此深入研究能够导致胃癌的各种遗传物质的变化尤其是基因的脱变、缺失等在胃癌进展中的作用机制,找到治疗胃恶性肿瘤的新途径或者是新的靶点,可以为其预防以及治疗提出切实可行的的方法或途径。早在1969年Britten等就已经提出激活RNA(activatorRNA)的概念,但未获得证实,此后直到2006年Li和Janowski等才分别发现并命名saRNA和RNAa:小分子的双链非编码RNA可以上调或增强靶基因的表达,而这种效应主要发生在DNA进行转录的时候,因此这种现象叫RNA激活(RNAa),而这种小分子的双链非编码RNA则称为激活小RNA(saRNA)。随后有关RNAa原理及作用机制的研究被不断地报道,进一步证实了 RNAa的可行性。p21WAF1/CIP1(p21),是一种受体广泛的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂,位于6p染色体,编码分子量为21k-Da的蛋白质,是野生型p53抑癌基因应对各种因素引起的基因损伤的下游激活产物,p21可以通过多种细胞信息传导途径调节细胞周期,改变细胞周期的进程调控细胞的增殖,这其中最为重要的是通过抑制某种特定的CDK复合物的活性,使细胞周期停止在G1期。针对p21WAF1/CIP1(p21)基因的小激活 RNA(saRNA),dsP21-322,已经在肝癌,肺癌,膀胱癌等多种癌细胞系中验证了有效性,但是在胃癌细胞中却未见相关报道。本研究拟应用RNA激活技术重新激活胃癌细胞中p21WAF1/CIP1(p21)基因的表达,明确小激活RNA(saRNA)转染胃癌细胞SGC-7901和M-28的最佳条件乃至发挥激活/上调作用的必要因素,研究其对靶细胞中的特定基因启动子的影响,进一步明确RNAa对恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移等生物学行为的影响,为胃癌的基因治疗提供必要的理论依据。在前期的相关研究中,本课题组的实验人员已经验证了saRNA(dsP21-322)在体外培养的胃癌细胞SGC-7901和M-28中的生物学作用。为进一步研究其作用机制,我们选取了由本课题组首次发现的抑癌基因VEZT为小激活RNA(saRNA)的靶基因。VEZT基因是近年新发现的与胃癌的发生发展息息相关的抑癌基因。VEZT在染色体的位置是12q22,具有12个外显子和11个内含子,编码的是一种由相连的三个组份组成的跨膜蛋白。VEZT蛋白主要包括三部分:短的细胞外区域,跨膜区域和长的细胞内区域,其中细胞外区域结合肌球蛋白ⅦA(myosin ⅦA)。前期的相关实验结果证明,上调胃SGC-7901和M-28细胞中VEZT的表达可以抑制胃SGC-7901和M-28细胞的生长、侵袭和迁移;VEZT的表达受启动子区特定部位的甲基化的影响,此外某一些非编码的由22个核苷酸组成的单链mi croRNA也能够影响VEZT的表达,而这种影响因素又和saRNA及RNAa上调目的基因的机制密切相关。因此为进一步证实saRNA的激活效应,以及探索saRNA的设计原则和作用机制,本研究针对VEZT的启动子序列,通过生物学软件设计了几条saRNA。随后通过Western Blot以及qRT-PCR筛选出能够显著提高VEZT蛋白和mRNA的含量的saRNA序列,然后以筛选出的saRNA转染胃癌细胞,进行相关实验。同时,构建pGPU6/GFP/Neo-shRNA表达载体加以转染,以排除saRNA的脱靶效应,从而进一步明确saRNA的靶向效应对胃癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法通过查找相关文献获取针对p21WAF1/CIP1(p21)基因的有效saRNA序列,即dsP21-322,以及dsControl(阴性对照序列)并加以合成。将不同浓度的dsP21-322转染胃癌细胞SGC-7901和M-28中。通过Western Blot筛选最合适的转染浓度。然后用选定的dsP21-322浓度处理SGC-7901和M-28细胞,处理时间长短各不相同。通过Western Blot筛选最合适的作用时间。按照上述筛选出的saRNA最佳作用浓度和时间,将dsP21-322、阴性对照序列(dsControl)均分别转入人胃SGC-7901和M-28细胞,即dsP21-322转染的SGC-7901和M-28作为实验组,dsControl转染的SGC-7901和M-28起阴性对照的作用,即dsControl组,用不含任何RNA序列的转染试剂Lipo2000处理目的细胞作为空白对照组,Mock组。通过CCK-8实验,观察并评估saRNA对胃SGC-7901和M-28细胞增殖能力的影响;通过Transwell assay观察并评估dsP21-322对胃SGC-7901和M-28细胞侵袭和迁移能力的影响.通过生物学软件设计针对胃癌细胞中抑癌基因VEZT的saRNA、dsControl序列,并加以合成。将合成好的saRNA分别转入胃癌细胞系SGC-7901和M-28中,通过Western Blot以及qRT-PCR检测VEZT蛋白和mRNA的含量,进而筛选出有效的saRNA。随后筛选出的有效saRNA被转入人胃SGC-7901和M-28细胞,将同时转有shRNA和筛选出的saRNA的SGC-7901、M-28细胞,也就是saRNA-shRNA组,作为阴性对照,以排除saRNA的脱靶效应,shRNA表达载体是带有荧光标记的pGPU6/GFP/Neo-shRNA。通过CCK-8实验以及Transwell assay实验评估筛选出的saRNA对SGC-7901和M-28恶性行为的影响。结果1.dsP21-322 能有效上调人胃癌细胞 SGC-7901 和 M-28 p21WAF1/CIP1(p21)基因表达,这种激活目的细胞的特定基因的行为具有时间剂量依赖性。2.dsP21-322的激活效应在转染浓度为50nM,作用时间为72h时激活效应的综合效果最好。3.dsP21-322 能够通过上调 SGC-7901 和 M-28 细胞 p21WAF1/CIP1(p21)mRNA及蛋白质的含量,抑制靶细胞的恶性行为。4.dsVEZT-94,能通过上调人胃癌细胞SGC-7901和M-28 VEZT mRNA及蛋白质的含量,进而抑制靶细胞的恶性行为。结论在本研究中,我们发现dsP21-322(saRNA)能够有效上调p21WAF1/CIP1(p21)基因的表达,提高p21WAF1/CIP1(p21)蛋白及mRNA的含量,进而抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移。此外,这种激活效应具有时间剂量依赖性,在saRNA转染浓度为50nM,转染时间为72h时,激活效应激活效应的综合效果最好。dsVEZT-94,能通过上调体外培养的靶细胞系SGC-7901和M-28 VEZT mRNA及蛋白质的含量,进而抑制靶细胞的恶性行为。本研究中这种生物学恶性行为主要包括增殖、侵袭和迁移。saRNA通过作用于抑癌基因启动子的特定序列,上调或激活靶基因的表达,从而实现抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移等恶性行为的目的,研究saRNA和RNAa的作用机制,能够为胃癌甚至其他恶性肿瘤的预防或者是治疗提供切实可行的方法,甚至是具有实际效果的治疗手段。