【摘 要】
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目的:通过体外实验研究山奈酚对小鼠巨噬RAW 264.7细胞和破骨细胞的增殖及分化作用,并进一步探讨山奈酚在MAPK信号通路对实验性牙周炎抗炎和抗破骨的影响,以了解山奈酚治疗实验性牙周炎的分子生物学机制方法:1、将小鼠巨噬细胞系RAW 264.7培育后用不同浓度山奈酚进行处理,以确定山奈酚的后续实验浓度:选择各种浓度的山奈酚对RAW 264.7细胞进行作用,在一定的时间之后,CCK-8对细胞的增殖
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目的:通过体外实验研究山奈酚对小鼠巨噬RAW 264.7细胞和破骨细胞的增殖及分化作用,并进一步探讨山奈酚在MAPK信号通路对实验性牙周炎抗炎和抗破骨的影响,以了解山奈酚治疗实验性牙周炎的分子生物学机制方法:1、将小鼠巨噬细胞系RAW 264.7培育后用不同浓度山奈酚进行处理,以确定山奈酚的后续实验浓度:选择各种浓度的山奈酚对RAW 264.7细胞进行作用,在一定的时间之后,CCK-8对细胞的增殖活性进行测定,为接下来的实验确定合适的山奈酚浓度。2、山奈酚对RAW 264.7细胞的抗炎和骨保护作用:实验随机分组为空白对照组（Control）,对照组（Pg.LPS）,处理组（Pg.LPS+山奈酚药物20 μM,40 μM,80 μM）,不同浓度山奈酚处理后实时荧光定量PCR检测细胞中OPG/RANKL及炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-1Ra相对表达量。3、MAPK信号通路在山奈酚影响RAW 264.7细胞抗炎过程中的作用:分组同上,不同浓度山奈酚处理后通过WB检测MAPK关键蛋白的表达。4、RAW 264.7细胞破骨诱导分化:用50 ng/mL浓度的RANKL将小鼠RAW 264.7细胞株诱导成破骨细胞并用TRAP染色确定。5、山奈酚对RAW 264.7细胞破骨相关因子的影响:实验随机分组,空白对照组（Control）、对照组（RANKL50ng/mL）、山奈酚实验组（50ng/mLRANKL+山奈酚药物20 μM,40 μM,80 μM）,不同浓度山奈酚处理后实时荧光定量PCR检测细胞中基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、活化T细胞核因子1（NFATC 1）、整合素αV（ITGAV）、整合素亚基β 3（ITGB 3）、c-Fos、OPG的相对表达量。6、MAPK信号通路在山奈酚影响RAW 264.7细胞在破骨形成中的作用:分组同5,并通过WB检测关键蛋白的表达。结果:1、CCK-8细胞活性实验结果显示160 μM浓度的山奈酚对细胞活性影响较大,后续实验选择20 μM、40 μM、80 μM的山奈酚。2、抗炎作用:实验性牙周炎炎症模型用药物处理后,细胞中促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平下调,抗炎因子IL-1Ra表达水平上调。MAPK信号通路中的p-JNK/JNK蛋白表达水平下调。3、骨保护作用:处理组山奈酚均可提高OPG/RANKL 比率,20 μM浓度组山奈酚表现出最佳的骨保护作用。4、50 ng/mL的RANKL诱导培养液作用于RAW 264.7细胞,五天后可观察到破骨细胞。5、抗破骨作用:山奈酚作用于诱导5天后的细胞,用q-PCR技术检测破骨相关基因表达情况,破骨细胞中MMP-9、NFATC 1、ITGAV、ITGB 3、c-Fos基因表达水平下调,OPG基因表达水平上调。MAPK信号通路蛋白ERK、p 38、JNK蛋白的磷酸化水平与对照组相比均下调。结论:1、80 μM及以下的山奈酚对实验性牙周炎无毒副作用。2、一定浓度范围内的山奈酚可以提高细胞内OPG/RANKL基因表达比率,具有一定的骨保护作用;同时通过抑制JNK/MAPK信号通路,下调促炎因子基因表达,抑制实验性牙周炎炎症进展。3、一定浓度山奈酚可以通过MAPK信号通路下调破骨细胞中MMP-9、NFATC 1、ITGAV、ITGB 3、c-Fos基因表达水平,上调OPG基因表达水平,对实验性牙周炎破骨细胞的形成、分化、增殖以及黏附起抑制作用。
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