论文部分内容阅读
[目的]从整体动物、细胞和分子水平,结合系统药理学靶点预测,研究中药复方肾康注射液(Shenkang,SK)对慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)和肾纤维化的保护作用和机制,为SK对CKD及肾纤维化的临床治疗提供更多的数据支持及科学依据。[方法]1.系统药理学:首先通过数据挖掘和文献查阅构建SK分子数据库,并通过药物相似性和药物半衰期评估来筛选活性分子;使用WES药物靶向模型来预测生物活性成分的直接药物靶向;使用Cytoscape 3.2软件构建复合物-靶标,靶标-通路和靶标-疾病网络,并根据BioGPS数据库确定靶标在组织和器官中的分布。2.整体动物:C57BL/6小鼠36只,采用随机对照设计法将小鼠按体重随机分为:假手术组,模型组,阳性药(ARB)组,SK高剂量组,SK中剂量组,SK低剂量组(n=6)。对模型组、ARB组、SK各剂量组小鼠实施UUO手术,制备肾纤维化模型,假手术组分离左输尿管但不结扎输尿管。术后第一天开始给药,共计14天。假手术组和模型组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,ARB组:尾静脉注射生理盐水0.13 mL/10g,灌胃氯沙坦钾溶液0.15 mL(生药0.13 g)/10 g,SK高剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL(生药0.08 g)/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK中剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL(生药0.04 g)/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,SK低剂量组:尾静脉注射SK 0.13 mL(生药0.02 g)/10 g,灌胃生理盐水0.15 mL/10 g,实验过程中观察记录小鼠体重等一般情况,给药第13天行MRI扫描测定FA值明确活体肾纤维化程度,给药14天后摘眼球取血,称量肾脏重量,分别冻存固定肾脏。比色法测定血肌酐、血尿素氮、血CysC水平,行HE和天狼星红染色观察患侧肾脏病理形态学和纤维化程度,透射电镜观察超微结构情况,Western Blot检测各组小鼠肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅰ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平,Real-time PCR检测假手术组、UUO组和SK中剂量组肾脏肌成纤维细胞标志物α-SMA,FSP-1、ECM成分(Col Ⅲ,JAK2、STAT3、TGF-β1和负调节分子SOCS1,SOCS3 mRNA水平。3.细胞:NRK-49F细胞进行复苏传代培养,以10 ng/mL 的TGF-β1刺激48 h诱导NRK-49F细胞增殖活化,不同浓度SK(0,1,2,4mg/mL)干预后,观察细胞形态、Western Blot检测NRK-49F细胞成纤维细胞标志物α-SMA,ECM成分Col Ⅲ,JAK2/STAT3通路分子蛋白磷酸化水平和负调节分子Prdx5的表达,Real-time PCR检测NRK-49F细胞肌成纤维细胞标志物α-SMA,JAK2、STAT3 mRNA 水平。[结果]1.系统药理学部分:以DL≥0.6为筛选标准,“HL=long”用于定义适当的HL范围。最终选出88种化合物作为活性分子。利用WES算法和CTD、TTD筛选结果,确定了 85个与治疗CKD相关的潜在化合物作用靶点,包括STAT3。通过KEGG数据库映射获得关键通路,包括NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF通路,结合CKD病理机制的相关进展,构建了 CKD治疗模块的通路,包括炎症、增殖、分化、迁移、通透性、降解等模块。对靶标-疾病相互作用网络的深入分析表明,SK治疗CKD主要通过影响6种疾病发挥作用:泌尿生殖系统疾病、代谢性疾病、内分泌疾病、心血管疾病,病理过程和免疫疾病。组织定位结果显示SK通过包括肾脏、肝脏、肺和心脏在内的组织模块发挥作用。2.整体动物部分:(1)肾功能检测:与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏血CREA、BUN、Cys-C水平显著性升高(p<0.01);与UUO组相比,ARB和高剂量SK组小鼠血CREA水平显著降低(p<0.01);与UUO组相比,ARB和SK各剂量组小鼠血BUN水平显著降低(p<0.05或p<0.01);与UUO组相比,SK高剂量组小鼠血Cys-C水平显著降低(p<0.05)。(2)肾脏重量和病理检测:与假手术组相比,UUO模型组的患侧肾质量/体重、患侧肾/对侧肾质量、对侧肾质量/体重均显著增加(p<0.05或p<0.01)。但各药物治疗后对UUO小鼠肾脏重量各指标没有产生影响。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏FA值显著性升高(p<0.01);与UUO组相比,ARB阳性药组、SK高中低剂量组FA值显著降低(p<0.01或p<0.001),其中以SK中剂量组最为显著(p<0.001)。与假手术组比较,UUO组小鼠肾脏病理损伤明显;与UUO组比较,各治疗组肾脏损伤情况均有不同程度缓解,细胞外基质积聚、炎性细胞浸润、肾小管扩张和/或萎缩减轻,以SK中剂量组和高剂量组较好。与假手术组比较,UUO组小鼠天狼星红面积极显著增加(p<0.001);与UUO组比较,ARB组、SK高、中、低剂量组小鼠患侧肾脏天狼星红染色红色面积显著减少(p<0.05或p<0.01)。电镜下观察各浓度SK对UUO所致的细胞器丰富的成纤维细胞增多,间质局灶胶原纤维增生和肾小管凋亡均有一定的改善作用。(3)Western blot检测:与假手术组相比,UUO组α-SMA蛋白水平显著增加(p<0.01),与UUO比较,SK中剂量组和低剂量组显著下调了 UUO状态下的α-SMA蛋白水平升高(p<0.05);与假手术组相比,UUO组Col Ⅰ蛋白水平显著增加(p<0.01),与UUO 比较,SK中剂量组显著下调了 Col Ⅰ蛋白水平升高(p<0.05);与假手术组相比,UUO组p-STAT3(Try705位点)/STAT3比例显著增加(p<0.01),与UUO比较,SK中(p<0.01)、低剂量(p<0.001)组显著下调了 Try705位点的STAT3磷酸化程度;与假手术组相比,UUO组p-JAK2(Try1007位点)/JAK2比例有上升趋势,但无统计学差异,与UUO 比较,SK高剂量组显著下调了 Try1007位点的JAK2磷酸化程度(p<0.05),(4)PCR检测:与假手术组相比,UUO组小鼠患侧ECM成分Col Ⅰ、Col Ⅲ、FN,成纤维细胞活化标志物α-SMA、FSP-1,以及 JAK2、STAT3、TGF-β、JAK2/STAT3 通路负调节因子SOCS1、SOCS3 mRNA水平显著上升(p<0.05或p<0.01或p<0.001);与UUO组相比,SK中剂量组显著降低了 Col Ⅰ、ColⅢ、FN,α-SMA、FSP-1,JAK2、TGF-β、SOCS1、SOCS3 mRNA 水平(p<0.05 或p<0.01)。3.细胞实验:TGF-β1诱导后,NRK-49F细胞的细胞骨架显示出内部微丝束,并逐渐增厚和伸长,丧失纺锤形或星形成纤维细胞外观。不同浓度的SK一定程度上逆转了TGF-β1诱导的形态变化和增殖。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞p-STAT3(Try705位点)/STAT3、Prdx5蛋白水平显著性升高(p<0.05),p-JAK2(Try1007位点)/JAK2有一定程度升高但未达统计学意义(p>0.05);与模型对照组相比,4 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的STAT3蛋白Try705位点的磷酸化水平显著降低(p<0.05),1 mg/mL SK组和2 mg/mL SK组细胞的JAK2蛋白Try1007位点的磷酸化水平显著降低(p<0.05),4 mg/mL SK组细胞的Prdx5蛋白表达水平显著降低(p<0.05)。与空白对照组比较,模型对照组成纤维细胞α-SMA、JAK2、STAT3 mRNA水平显著升高(p<0.05或p<0.001);与模型对照组相比,ARB及不同浓度SK均极显著地降低了α-SMA mRNA 水平(p<0.001),与模型对照组相比,ARB、1mg/mL、2 mg/mL SK(p<0.05)及 4 mg/mL SK(p<0.01)显著降低了 STAT3 mRNA 水平,与模型对照组相比,ARB及4 mg/mL SK显著降低了 JAK2 mRNA水平(p<0.05)。[结论](1)系统药理学预测显示SK中多种化合物可能通过作用于与炎症、凋亡、增殖等相关的NF-κB、MAPK、TRP离子通道和VEGF等多通路的靶点分子治疗CKD。(2)SK有效改善UUO小鼠肾功能指标和肾间质纤维化,其机制可能是通过调节JAK2/STAT3信号通路抑制成纤维细胞活化实现的,验证了系统药理学结果。(3)SK还能够抑制TGF-β1诱导NRK-49F增殖活化以及ECM产生,其作用机制可能是通过抑制JAK2/STAT3通路的激活介导的。