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目的：1.观察白细胞介素-35(IL-35)对T淋巴细胞凋亡的影响。2.探讨IL-35在影响T淋巴细胞凋亡中的时间、剂量关系。3.探讨IL-35促进T淋巴细胞凋亡作用机制。方法：采用Clone E6-1人类T淋巴细胞白血病细胞(T细胞系Jurkat,中国科学院细胞资源库提供),作为实验对象。用含有10%FBS RPMI1640培养液培养,每48h更换细胞培养液,72h进行细胞传代。以每毫升1×106数量级细胞作为实验需要标准样品。从上述样品中取1×106/ml细胞分别接种于12孔细胞培养板中,应用不同刺激浓度(10ng/ml,80ng/ml,640ng/ml)细胞介素-35(IL-35)与其分别共培养24h,36h。在达到时间点后,收集细胞,并将细胞分成N组(Normal)、C组(Control)、10ng/ml组、8Ong/ml组、640ng/ml组。实验一：应用流式细胞检测技术,使用美国BD公司Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒,应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。并进行统计学分析,解释凋亡现象。实验二：选取24h 10ng/ml组、80ng/ml组、640ng/ml组,为实验对象。应用Western Blot方法检测B细胞淋巴瘤2蛋白(Bcl-2)表达情况、Akt Ser473位点磷酸化情况。应用ELIS A试剂盒检测各组caspse-3,8,9的蛋白表达变化情况。进行统计学分析,解释其意义。实验三、应用流式细胞检测技术,使用abcom公司的Fluo-3 AM钙离子探针检测上述各组的细胞内Ca2+浓度,并进行统计学分析。结果：1.IL-35促进T淋巴细胞凋亡,并存在时间/剂量关系。实验结果表明,加入IL-35与Jurkat细胞共培养24h、36h与正常组(N组)及对照组(C组)比较凋亡率均升高(P<0.01)。24h、36h在10ng/ml浓度IL-35的刺激下,与N组及C组比较可出现凋亡率上升的现象(P<0.01)。在10ng/ml、80ng/ml的IL-35相同浓度下,36h的凋亡率高于24h (P<0.01),640ng/ml的IL-35相同浓度下,24h的凋亡率高于36h(P<0.01)。24h相同时间点,随IL-35浓度的增加(80ng/ml、 640ng/ml)与N组及C组比较凋亡率呈上升趋势(P<0.01)；在IL-35浓度达到640ng/ml寸,凋亡率达到最高,如图1。36h相同时间点,凋亡率随着IL-35浓度的增加,在80ng/ml时凋亡率达到最高,如图1。2.检测24h,10ng/ml、80ng/ml、640ng/ml组的Bcl-2蛋白及AktSer473的磷酸化表达。1Ong/ml组Bcl-2蛋白与Control组比较表达降低(P<0.05)。且随IL-35浓度增加,Bcl-2蛋白与Control组比较表达呈逐渐下降趋势(P<0.01)。640ng/ml时,Bcl-2蛋白的与Contr ol组比较,表达显著下降,并达到最低值(P<0.01)。80ng/ml组、640ng/ml组AktSer473磷酸化与Control组比较表达明显受到抑制,且在IL-35640ng/ml时磷酸化表达与Control组比较达到最低(P<0.01)。3.检测24h,10ng/ml、80ng/ml、640ng/ml组的Caspase-3,8,9。与Normal、Contral组比较,Caspase3,9的表达从10ng/ml开始升高,640ng/ml时与Control组比较均达到最高峰值(P<0.01)。Caspase-8在此凋亡过程中几乎不表达,如图7。4.检测24h,10ng/ml、80ng/ml、640ng/ml组的细胞内Ca2+浓度变化。细胞内Ca2+浓度随IL-35浓度升高呈上升趋势,且在640ng/ml刺激浓度时,达到峰值,如图8。结论：1.IL-35促进T淋巴细胞凋亡,并受时间、剂量关系影响。2.IL-35促T淋巴细胞凋亡作用机制中,相关细胞凋亡因子：Bcl-2, Caspase-3,9、细胞内Ca2+及AktSer473磷酸化位点变化与IL-35存在量效关系。3.IL-35促进T淋巴细胞凋亡中,线粒体凋亡途径可能起重要作用。