侵袭性真菌病（Invasive fungal disease, IFD）系指真菌侵入人体，在组织、器官或血液中生长、繁殖，并导致炎症反应及组织损伤的系统性感染性病变。该病在临床上起病隐匿，主要并发于恶性肿瘤、糖尿病和自身免疫病等免疫功能下降的病人。随着广谱抗生素、免疫抑制剂的广泛使用及导管插管和器官移植等新技术的开展，侵袭性真菌病的发病率和死亡率急剧上升。侵袭性真菌病的疗效和转归很大程度上取决于早期诊断，但由于病人的临床表现不明显、病理组织活检具有创伤性、真菌培养鉴定周期长及真菌抗原和抗体检测尚未完全成熟，目前临床要早期准确诊断IFD仍然非常困难。　　近年来，侵袭性真菌病的血清学诊断试验有了一定的发展，通过检测真菌细胞壁的特有结构成分(1,3)-β-D-葡聚糖所建立的检测方法呈现出良好的应用前景。其中，以G试验为检测原理的(1,3)-β-D-葡聚糖检测项目具有代表性。这类方法能够实现早期快速检测，具有一定的敏感性和特异性，但仍存在较大局限性，检测方法单一，影响因素较多。葡聚糖自身理化性质如分子量、分子构象的改变均会影响活化G因子的能力，其中涉及的酶促级联反应易受内毒素干扰出现假阳性的情况。因此，提高侵袭性真菌病的诊断效率具有非常重要的临床意义。本研究计划在获得可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的基础上，通过SELEX技术筛选与其结合的DNA适配体，为后续建立基于适配体的侵袭性真菌病感染性标志物(1,3)-β-D葡聚糖的检测新方法奠定基础。　　目的:　　1.建立酸碱法-氧化超声法提取白色念珠菌细胞壁中的可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖，为其DNA适配体的筛选研究提供物质基础。　　2.对提取的可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖进行生物素标记，使其可固定在链霉亲和素磁珠上，便于DNA适配体的筛选。　　3.应用SELEX技术筛选与(1,3)-β-D-葡聚糖高亲和力和高特异性结合的DNA适配体。测定已富集的DNA适配体的结合力和解离常数，为建立基于DNA适配体的(1,3)-β-D-葡聚糖检测新方法奠定基础。　　4.分析以 G试验为原理的血清(1,3)-β-D-葡聚糖检测对侵袭性真菌病的诊断价值，为临床科学应用G试验诊断侵袭性真菌病提供依据。　　方法:　　1.采用酵母膏胨葡萄糖（YPD）液体培养基培养白色念珠菌，应用酸碱法提取念珠菌细胞壁中的酸碱不溶性葡聚糖，并经氧化超声法处理获得可溶性的(1,3)-β-D-葡聚糖。采用理化方法对可溶性的(1,3)-β-D-葡聚糖进行定性及定量分析，利用红外光谱对酸碱不溶性及可溶性(1,3)-β-D-葡聚糖的糖苷键进行鉴定分析。　　2.采用高碘酸钠氧化(1,3)-β-D-葡聚糖，经乙二胺胺化后与硼氢化钠反应生成席夫碱（Schiff base），加入生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺（BNHS），与反应后的(1,3)-β-D-葡聚糖形成酰胺键，实现生物素标记。通过红外光谱分析鉴定标记产物。经Sephadex G-200柱层析技术对标记的(1,3)-β-D-葡聚糖进行纯化及分子量分析。　　3.设计合成83nt长度的随机单链DNA（ssDNA）文库，与生物素标记(1,3)-β-D-葡聚糖共同孵育，结合靶分子的ssDNA文库洗脱后经PCR扩增获得双链 DNA（dsDNA）库，dsDNA解链成相应的 ssDNA后用于下一轮筛选。经过20轮SELEX筛选，ssDNA文库经PCR扩增后克隆至T载体，转化感受态细胞后随机挑取54个克隆菌进行测序，利用Mfold软件分析适配体的二级结构，测定适配体与(1,3)-β-D-葡聚糖的结合能力及其解离常数。　　4.收集2014年1月至2015年7月间在广州医科大学附属第一医院确诊的52例侵袭性真菌病住院患者（IFD组）、50例革兰阳性菌血症患者（G+菌组）、53例革兰阴性菌血症患者（G-菌组）的病例资料及41例健康对照组的检验资料；分析52例侵袭性真菌病的致病菌分布情况及各组之间的G试验检测水平，运用受试者工作曲线（ROC）评估(1,3)-β-D葡聚糖检测诊断IFD的最佳临界值。统计学分析使用SPSS13.0软件，计量数据以中位数（四分位间距）形式进行描述，两组间比较采用非参数检验中的Mann-Whitney U检验。P<0.05为差异有统计学意义。　　结果:　　1.从白色念珠菌细胞壁中分离、提取了可溶性的(1,3)-β-D-葡聚糖，经苯酚-硫酸法鉴定为多糖阳性反应，糖元和蛋白检测均为阴性反应；利用苯酚-硫酸法定量检测，(1,3)-β-D-葡聚糖含量高达91.31％；采用红外光谱分析其结构，提取的葡聚糖在894cm-1有特征吸收峰，表明葡聚糖为β-构型，在1042 cm-1、1077 cm-1处有吸收峰，显示结构为D-吡喃糖苷。　　2.生物素标记的(1,3)-β-D-葡聚糖经红外光谱鉴定显示，在1550cm-1处出现新的吸收峰，表明是新生成的酰胺键伸缩振动；在849cm-1处出现的吸收峰则表示生物素标记的长链带伸缩振动。经Sephadex G-200柱层析技术确定分子量约为143KDa。　　3.经过20轮筛选后进行克隆测序，在获得50条序列中，以90%以上一致性/同源性的序列归为一组，可分为9组，共包含23条序列，其中有8组具有两条或以上的相同序列，筛选的ssDNA文库得到了富集。运用Mfold软件分析各适配体的二级结构，结果显示其以茎-环结构为主，各适配体环的大小、位置、数量等存在区别。选择8组具有2条以上相同序列的适配体进行结合能力检测，其中G1-45适配体的结合能力最高，Kd值为14.05±3.98 nM。　　4.从52名IFD确诊患者中分别检出曲霉、假丝酵母菌属、毛霉、马尔尼菲青霉和孢子菌等7种致病真菌属。在IFD组中血清(1,3)-β-D-葡聚糖含量达124.1(60.39-218.13) pg/mL；G+菌组、G-菌组及健康对照组中(1,3)-β-D-葡聚糖含量分别为23.57(15.31-53.19) pg/mL、23.45(15.66-45.36) pg/mL和25.86(15.34-37.26) pg/mL。IFD组(1,3)-β-D-葡聚糖含量明显高于其他三组，差异具有统计学意义（Z=-4.183,-4.337,-4.978, P<0.001）。G+菌组、G-菌组与健康对照组间两两比较则差异无统计学意义（P>0.05）。ROC曲线分析显示血清(1,3)-β-D-葡聚糖水平用于诊断IFD的最佳临界值是60.36 pg/mL，曲线下面积最大为0.759（P<0.001），95%可置信区间0.693-0.818，灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为76.9%、83.3%、62.5%和90.9%。　　结论:　　1.采用酸碱法-氧化超声法从白色念珠菌细胞壁中提取了可溶性的(1,3)-β-D-葡聚糖，为DNA适配体筛选的研究提供了物质基础。　　2.(1,3)-β-D-葡聚糖与生物素之间通过生成酰胺键进行连接，经红外光谱分析显示(1,3)-β-D-葡聚糖成功实现生物素标记，利于后续的适配体筛选。　　3.成功构建了体外筛选(1,3)-β-D-葡聚糖DNA适配体的技术平台，适配体与(1,3)-β-D-葡聚糖结合的基础结构是茎-环结构，获得了一条高结合力和高亲和力的适配体，为研制(1,3)-β-D-葡聚糖的新型检测系统奠定基础。　　4. IFD组的(1,3)-β-D-葡聚糖水平明显高于其他非IFD组，G试验具有一定的敏感性和特异性，为临床科学应用G试验诊断IFD提供客观依据。