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研究背景和目的:
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是新发的单股正链RNA且有包膜黄病毒属的病毒，ZIKV感染可引起新生儿小头畸形和格林巴利综合征等神经性系统疾病，它引起上述神经系统损伤得到了世界的广泛关注。然而其感染后致病机制尚不清楚。到目前为止，尚没有被批准的抗病毒药物和疫苗上市。
Ⅰ型干扰素介导的抗病毒免疫反应在天然免疫中发挥着重要的作用，病毒产生多种拮抗机制来完成自身复制，最终逃逸干扰素介导的抗病毒反应。最近的研究表明，ZIKV进化出多种机制来逃逸宿主的抗病毒免疫反应。然而，ZIKV如何利用宿主基因逃逸IFN信号通路的分子机制尚不透彻。有研究发现，ZIKV感染后能够引起ISG15mRNA表达升高，ISG15为干扰素刺激基因，它可被干扰素刺激诱导并表达ISG15蛋白。因ISG15蛋白结构与泛素相似，又称为类泛素蛋白质。它具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能，虽然ISG15一直被认为具有抗病毒功能，能够抑制多种DNA病毒和RNA病毒的复制和释放，但是基于我们课题组的前期研究发现ISG15能够促进HBV和HCV的复制，那么ISG15在A549细胞中对ZIKV复制具有怎样的影响呢？
本课题从以下几个方面ISG15对ZIKV感染中的作用进行了初步探讨:(1)ISG15对ZIKV复制的影响;(2)ISG15对ZIKV复制的影响是否通过Ⅰ型干扰素介导的Jak/STAT信号通路;(3)ISG15编码的ISG15蛋白在细胞中存在游离型和结合型，ISG15以哪种形式发挥其对病毒的调节功能。ZIKV感染后逃逸宿主的先天免疫反应是十分复杂的，至今仍未完全阐明。本研究ISG15在ZIKV复制过程中的影响及其作用机制为寻找新型ZIKV治疗提供新思路和药物靶点。
实验方法:
1.ZIKV感染A549细胞、2fTGH细胞和U5A细胞，通过不同时间点收取细胞样品，通过realtimePCR等方法检测ISG15、IFNα、IFNβ、IFNλ和IFNγmRNA及ZIKVNS5的RNA;高表达或敲低ISG15感染ZIKV的A549细胞，通过realtimePCR，westemblot及IFC检测ZIKVNS5的RNA，NS1蛋白及capsid蛋白表达情况。
2.敲低ISG15后感染ZIKV，通过realtimePCR检测IFNα、IFNβ、ZIKVNS5RNA，高表达ISG15在感染ZIKV的A549、2fTGH和U5A细胞中，通过realtimePCR等方法检测ZIKVNS5的RNA;高表达ISG15在感染ZIKV的A549、2fTGH和U5A细胞中，不加和加IFNβ两组，通过westernblot、双荧光报告基因系统和realtimePCR检测Jak/STAT信号通路中STAT1和STAT2的磷酸化水平、ISRE的活性、干扰素刺激基因ISG(MxA和IFIT1)表达水平及ZIKVNS1蛋白的表达水平。
3.敲低ISG15感染ZIKV，通过westernblot检测ISGylation，ZIKVNS1的蛋白水平;敲低UbE1L感染ZIKV，通过realtimePCR和westernblot检测ZIKV的NS5RNA和NS1蛋白表达;由于ISG15LRLRGG是形成ISGylation的关键位点，我们通过位点突变的方式使其突变为无活性的ISG15LRLRAA，高表达ISG15和ISG15LRLRAA质粒在A549细胞中。最后通过westernblot验证质粒表达和realtimePCR检测ZIKVNS5的RNA表达水平。
结果:
1.ZIKV能够感染并在A549细胞、Vero细胞、huh7.0细胞、2tTGH细胞和U5A细胞中稳定增殖，在A549细胞、2tTGH细胞和U5A细胞能够引起干扰素α、β、λ、γ、ISG15的产生。由于U5A细胞为I型干扰素受体IFNAR缺失的细胞，ZIKV感染后能够诱导ISG15产生，表明ISG15的产生不完全依赖于Ⅰ型干扰素。在A549细胞中，高表达和敲低ISG15后均不影响ZIKV的入胞和内吞，ISG15不与ZIKV的RNA结合，但是可与NS4A结合，高表达ISG15促进ZIKV复制并存在剂量依赖，敲低ISG15抑制ZIKV复制。
2.敲低ISG15能够促进干扰素α、β、λ产生，在干扰素受体IFNAR缺失的U5A细胞中，高表达ISG15对ZIKV复制没有影响，而在信号通路完整的2fTGH细胞和A549细胞中，高表达ISG15可以下调STAT1和STAT2的磷酸化水平，降低ISRE的活性，最后MxA和IFIT1等ISG表达降低。从而促进ZIKV的复制。
3.敲低ISG15后感染ZIKV，ISGylation减弱，抑制ZIKV复制;因为UbE1L是ISG15发生ISGylation的起始激活酶，敲低UbE1L后ZIKV在RNA和蛋白水平都受到抑制;通过位点突变将ISG15蛋白的关键位点LRLRGG突变成LRLRAA，高转ISG15和ISG15LRLRAA在感染ZIKV的A549细胞中，结果表明野生型ISG15促进ZIKV复制及分泌，突变后的ISG15LRLRAA不影响病毒复制及分泌。
结论:
1.ZIKV感染细胞后能够引起ISG15mRNA产生，但是ISG15的产生不完全依赖于内源性的Ⅰ型干扰素信号通路。
2.高表达或敲低ISG15不影响ZIKV的入胞和内吞过程，ISG15不与ZIKV的RNA存在相互作用，可与ZIKV的非结构蛋白NS4A发生相互作用。ISG15能够促进ZIKV的复制及分泌。
3.ISG15通过负调控Ⅰ型干扰素介导的Jak/STAT信号通路促进ZIKV的复制及其分泌。
4.ISG15促进ZIKV复制可以通过ISGylation。
寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)是新发的单股正链RNA且有包膜黄病毒属的病毒，ZIKV感染可引起新生儿小头畸形和格林巴利综合征等神经性系统疾病，它引起上述神经系统损伤得到了世界的广泛关注。然而其感染后致病机制尚不清楚。到目前为止，尚没有被批准的抗病毒药物和疫苗上市。
Ⅰ型干扰素介导的抗病毒免疫反应在天然免疫中发挥着重要的作用，病毒产生多种拮抗机制来完成自身复制，最终逃逸干扰素介导的抗病毒反应。最近的研究表明，ZIKV进化出多种机制来逃逸宿主的抗病毒免疫反应。然而，ZIKV如何利用宿主基因逃逸IFN信号通路的分子机制尚不透彻。有研究发现，ZIKV感染后能够引起ISG15mRNA表达升高，ISG15为干扰素刺激基因，它可被干扰素刺激诱导并表达ISG15蛋白。因ISG15蛋白结构与泛素相似，又称为类泛素蛋白质。它具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能，虽然ISG15一直被认为具有抗病毒功能，能够抑制多种DNA病毒和RNA病毒的复制和释放，但是基于我们课题组的前期研究发现ISG15能够促进HBV和HCV的复制，那么ISG15在A549细胞中对ZIKV复制具有怎样的影响呢？
本课题从以下几个方面ISG15对ZIKV感染中的作用进行了初步探讨:(1)ISG15对ZIKV复制的影响;(2)ISG15对ZIKV复制的影响是否通过Ⅰ型干扰素介导的Jak/STAT信号通路;(3)ISG15编码的ISG15蛋白在细胞中存在游离型和结合型，ISG15以哪种形式发挥其对病毒的调节功能。ZIKV感染后逃逸宿主的先天免疫反应是十分复杂的，至今仍未完全阐明。本研究ISG15在ZIKV复制过程中的影响及其作用机制为寻找新型ZIKV治疗提供新思路和药物靶点。
实验方法:
1.ZIKV感染A549细胞、2fTGH细胞和U5A细胞，通过不同时间点收取细胞样品，通过realtimePCR等方法检测ISG15、IFNα、IFNβ、IFNλ和IFNγmRNA及ZIKVNS5的RNA;高表达或敲低ISG15感染ZIKV的A549细胞，通过realtimePCR，westemblot及IFC检测ZIKVNS5的RNA，NS1蛋白及capsid蛋白表达情况。
2.敲低ISG15后感染ZIKV，通过realtimePCR检测IFNα、IFNβ、ZIKVNS5RNA，高表达ISG15在感染ZIKV的A549、2fTGH和U5A细胞中，通过realtimePCR等方法检测ZIKVNS5的RNA;高表达ISG15在感染ZIKV的A549、2fTGH和U5A细胞中，不加和加IFNβ两组，通过westernblot、双荧光报告基因系统和realtimePCR检测Jak/STAT信号通路中STAT1和STAT2的磷酸化水平、ISRE的活性、干扰素刺激基因ISG(MxA和IFIT1)表达水平及ZIKVNS1蛋白的表达水平。
3.敲低ISG15感染ZIKV，通过westernblot检测ISGylation，ZIKVNS1的蛋白水平;敲低UbE1L感染ZIKV，通过realtimePCR和westernblot检测ZIKV的NS5RNA和NS1蛋白表达;由于ISG15LRLRGG是形成ISGylation的关键位点，我们通过位点突变的方式使其突变为无活性的ISG15LRLRAA，高表达ISG15和ISG15LRLRAA质粒在A549细胞中。最后通过westernblot验证质粒表达和realtimePCR检测ZIKVNS5的RNA表达水平。
结果:
1.ZIKV能够感染并在A549细胞、Vero细胞、huh7.0细胞、2tTGH细胞和U5A细胞中稳定增殖，在A549细胞、2tTGH细胞和U5A细胞能够引起干扰素α、β、λ、γ、ISG15的产生。由于U5A细胞为I型干扰素受体IFNAR缺失的细胞，ZIKV感染后能够诱导ISG15产生，表明ISG15的产生不完全依赖于Ⅰ型干扰素。在A549细胞中，高表达和敲低ISG15后均不影响ZIKV的入胞和内吞，ISG15不与ZIKV的RNA结合，但是可与NS4A结合，高表达ISG15促进ZIKV复制并存在剂量依赖，敲低ISG15抑制ZIKV复制。
2.敲低ISG15能够促进干扰素α、β、λ产生，在干扰素受体IFNAR缺失的U5A细胞中，高表达ISG15对ZIKV复制没有影响，而在信号通路完整的2fTGH细胞和A549细胞中，高表达ISG15可以下调STAT1和STAT2的磷酸化水平，降低ISRE的活性，最后MxA和IFIT1等ISG表达降低。从而促进ZIKV的复制。
3.敲低ISG15后感染ZIKV，ISGylation减弱，抑制ZIKV复制;因为UbE1L是ISG15发生ISGylation的起始激活酶，敲低UbE1L后ZIKV在RNA和蛋白水平都受到抑制;通过位点突变将ISG15蛋白的关键位点LRLRGG突变成LRLRAA，高转ISG15和ISG15LRLRAA在感染ZIKV的A549细胞中，结果表明野生型ISG15促进ZIKV复制及分泌，突变后的ISG15LRLRAA不影响病毒复制及分泌。
结论:
1.ZIKV感染细胞后能够引起ISG15mRNA产生，但是ISG15的产生不完全依赖于内源性的Ⅰ型干扰素信号通路。
2.高表达或敲低ISG15不影响ZIKV的入胞和内吞过程，ISG15不与ZIKV的RNA存在相互作用，可与ZIKV的非结构蛋白NS4A发生相互作用。ISG15能够促进ZIKV的复制及分泌。
3.ISG15通过负调控Ⅰ型干扰素介导的Jak/STAT信号通路促进ZIKV的复制及其分泌。
4.ISG15促进ZIKV复制可以通过ISGylation。