【摘 要】
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动脉内腔管壁脂质沉积促进斑块形成,单核巨噬细胞在病患处大量吞噬脂类转化为泡沫细胞,诱发血管内膜受损处发生炎症反应,促使动脉粥样硬化形成。靶向纳米药物在动脉粥样硬化的防治中具有很好的应用前景,但是开发高效、安全的纳米药物载体系统仍存在巨大挑战。聚酰胺-胺PAMAM是目前研究最深入的树枝状高分子之一,具有许多优良特性。本研究以多肽树枝状高分子聚酰胺-胺（PAMAM G5.0）作为载体,分别将β-环糊精
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动脉内腔管壁脂质沉积促进斑块形成,单核巨噬细胞在病患处大量吞噬脂类转化为泡沫细胞,诱发血管内膜受损处发生炎症反应,促使动脉粥样硬化形成。靶向纳米药物在动脉粥样硬化的防治中具有很好的应用前景,但是开发高效、安全的纳米药物载体系统仍存在巨大挑战。聚酰胺-胺PAMAM是目前研究最深入的树枝状高分子之一,具有许多优良特性。本研究以多肽树枝状高分子聚酰胺-胺（PAMAM G5.0）作为载体,分别将β-环糊精（β-CD）、靶向分子岩藻糖（Fucose）修饰到PAMAM G5.0表面,构建靶向动脉粥样硬化斑块相关巨噬细胞纳米载药系统,Fucose能特异性识别并结合巨噬细胞表面CD206受体,β-CD作为活性分子能够增加胆固醇的溶解性,并能包合溶解巨噬泡沫细胞内胆固醇结晶,促进巨噬细胞内胆固醇外排,因此两者的协同作用可以使载药系统特异性靶向巨噬细胞,且在斑块处起到一定的治疗作用,为动脉粥样硬化的靶向治疗提供了新策略。本研究主要内容具体如下:1、靶向纳米粒子的构建与表征。将树枝状高分子PAMAM G5.0作为载体,在其表面进行修饰,首先β-CD通过CDI活化,经取代反应将β-CD修饰到G5.0表面,得到中间产物CD-G5纳米粒子;然后,通过巯基丙酸的桥连作用,一端连接具有靶向配体Fucose分子,另一端通过缩合反应连接到G5.0表面,构建CD-G5-S-Fuc靶向纳米粒子;通过FT-IR与~1HNMR验证纳米粒子的化学结构,采用Zeta电位及粒度分析仪测定纳米载体的平均粒径分布,所得到的纳米粒子平均粒径大约为8.97 nm。2、靶向纳米粒子生物相容性及靶向性研究。通过MTT实验测试纳米粒子的细胞活性,结果显示通过β-CD与Fucose修饰后的纳米粒子毒性明显低于未修饰之前,说明构建的纳米粒子具有良好的生物相容性。以体外细胞摄取实验验证纳米粒子对巨噬细胞的靶向性,相同条件下用CD-G5-S-Fuc-FITC和CD-G5-FITC纳米粒子孵育细胞,荧光显微镜成像图显示,连接靶向分子Fucose的纳米粒子CD-G5-S-Fuc比不连靶向分子Fucose的CD-G5纳米粒子荧光更强,平均荧光强度大,成时间依赖性,并具有统计学意义（n=3,*p<0.05）,细胞加入不同浓度Fucose培养后,再用CD-G5-S-Fuc-FITC继续孵育细胞,荧光显微镜成像图显示,随着游离Fucose浓度增大,荧光变弱,平均荧光强度变小,被细胞摄取的纳米粒子减少,表明Fucose分子可以特异性结合巨噬细胞表面的CD206受体,与纳米粒子CD-G5-S-Fuc-FITC形成竞争作用,抑制纳米粒子被摄取,由于Fucose分子可以特异性结合巨噬细胞表面的CD206受体,因此使纳米粒子CD-G5-S-Fuc具有靶向巨噬细胞的功能。3、靶向纳米粒子诱导巨噬细胞胆固醇外流的研究。利用BODIPY-胆固醇探针标记法研究纳米粒子CD-G5-S-Fuc诱导细胞内胆固醇外流的情况,荧光显微镜拍摄荧光成像图,结果显示,相比空白对照组,200 nM CD-G5-S-Fuc实验组的平均荧光强度最小,并且小于阳性对照组100μM HP-β-CD。平均荧光强度越小,表明细胞内BODIPY-胆固醇流出越多,200 nM CD-G5-S-Fuc组诱导胆固醇从巨噬细胞流出的性能最好。结合以上研究,我们构建的靶向纳米载体系统CD-G5-S-Fuc,生物相容性好,可以特异性靶向巨噬细胞,并能移除巨噬细胞中的胆固醇。期待CD-G5-S-Fuc纳米载药系统能应用于临床上动脉粥样硬化的靶向治疗。
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