在我国，每年新生儿出生缺陷多达80万至120万，出生缺陷发生率约为4%~6%，给家庭和社会带来了沉重的精神压力和经济负担。目前针对新生儿出生缺陷最有效地应对措施是尽早进行产检筛查和诊断，发现后及时终止妊娠是降低新生儿出生缺陷发生率的有效途径。目前常规使用的羊水细胞法、绒毛细胞法及胎儿脐带血法等有创性产前诊断方法，对胎儿和孕妇都有一定的危险性，而超声和血清学筛查等无创性产前检测方法灵敏度和准确性较差。因此发展新的无创性产前检测方法具有重要的临床意义，一直是当前国际医学遗传学和生殖医学界关注的焦点之一。1997年Lo等发现在孕妇血浆中存在着少量的游离胎儿DNA（Cell-free fetalDNA，cffDNA），为无创性产前检测方法提供了新的途径。孕妇从怀孕第7周开始即可检测到cffDNA，在最初3个月内cffDNA含量每周增加约21%，在随后的3个月进入平台期，在分娩前又迅速增加，分娩后2小时内迅速消失。CffDNA的这一特点使其可以早期、特异地进行产前筛查和诊断，且不易受到以往妊娠的干扰，由此可见，孕妇血浆中的cffDNA是进行无创性产前检测的理想检材。但孕妇血浆中cffDNA含量极少，仅为血浆总游离DNA的19%左右，提取较为困难，丢失量大，检验灵敏度较低，并且cffDNA与大量的母体DNA背景混杂在一起，现有的对于孕妇血浆中cffDNA的研究，都是在较高的母体DNA背景下进行分析检测，极容易引起误差，而近年来备受关注的二代测序技术，其高昂的价格限制了其在临床检测中的普及应用。如何尽可能消除母体DNA背景干扰，提高胎儿DNA浓度，从而提高诊断的准确率，成为了亟待解决的问题。只有在胎儿DNA的富集方面有所突破，才能有效地提高诊断的准确率，因此，需要一种可以有地效富集cffDNA以达到常规技术检测所需用量的新方法。Chan等发现，血浆中大多数cffDNA分子片段长度小于300bp，而大多数母体来源的DNA分子片段长度大于300bp，根据这一重要特点，可以依据DNA分子片段长度的差异，特异性富集片段长度小于300bp的DNA分子，从而达到高效富集cffDNA的目的。目前，国际上主要通过琼脂糖凝胶电泳法富集cffDNA分子，但是这种方法操作时间长、精确度低，并且极容易带入污染物。国内外尚无高效、特异地从孕妇血浆中富集分离cffDNA，从而进行无创产前检测的技术。扩增片段长度多态性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）是基于聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）的一种选择性扩增限制性片段的方法。基本原理为首先使用限制性内切酶对基因组DNA进行切割，然后使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接，以接头序列为模板对DNA进行整体扩增。利用这一原理，可以通过在cffDNA的两端连接通用序列接头的方法将cffDNA进行整体扩增。DNA分子的解链温度与分子长度、碱基组成、缓冲的离子强度等因素有关，在PCR反应中，适当的降低变性温度可以起到减少或抑制长链DNA模板扩增的效果，而短链DNA模板不受影响。利用这一原理，可以通过降低变性温度选择性扩增短链DNA分子。本课题在常规的AFLP技术原理基础上进行了改进，通过优化整体扩增的反应条件及反应体系，建立了一种在保留DNA片段完整性的同时选择性扩增孕妇血浆中cffDNA片段的方法，为利用孕妇血浆中cffDNA进行无创性产前检测奠定了实验基础。最后，以选择性扩增的cffDNA分子为检材，建立一种针对21-三体综合征的无创性产前检测新方法。本研究分为4个部分：1、血浆游离DNA提取方法的建立及比较。分别利用经1次/2次酚-氯仿-异戊醇抽提法、经1次/2次酚-氯仿-异戊醇抽提配合微量DNA助沉剂法以及介孔纳米磁珠法提取血浆游离DNA，比较各种方法的提取效率。2、基于AFLP技术选择性扩增孕妇血浆中游离胎儿DNA方法的建立。基于AFLP原理，将经过改进的通用引物接头与经过预处理的血浆游离DNA进行连接，然后以通用引物接头为模板扩增所有DNA分子。根据DNA分子的解链温度与分子长度、碱基组成、离子强度等因素的关系，优化PCR反应条件及反应体系，建立选择性扩增特定长度模板片段的PCR扩增方法。最后利用该方法选择性扩增并回收孕妇血浆中长度小于300bp的DNA片段，建立一种在保留DNA片段完整性的同时选择性扩增孕妇血浆中cffDNA的方法。3、孕妇血浆DNA实时荧光定量PCR内参基因的筛选。比较在应用荧光定量PCR技术针对cffDNA的研究中经常使用的6种内参基因（HBB、TERT、GAPDH、ALB、ACTB、TRG）分别在孕妇血浆DNA、非孕妇血浆DNA以及孕妇血浆DNA中大于300bp的DNA（视为母体来源的DNA）、孕妇血浆中小于300bp的DNA（视为胎儿来源的DNA）中的含量稳定性。4、基于AFLP技术诊断21-三体综合征方法的建立。以经过选择性扩增获得的孕妇血浆cffDNA为检测底物，联合使用4种21号染色体特异性识别片段作为目标基因，应用荧光定量PCR法检测21号染色体的相对含量，通过判别分析建立一个线性判别函数，用以进行正常组及21-三体综合征组的判别预测，建立一种21-三体综合征的检测方法。本研究得到如下结论：1、比较了5种血浆游离DNA的提取方法，证明了经1次酚-氯仿-异戊醇抽提配合微量DNA助沉剂法成本较低，提取产量大，DNA损失相对较少，纯度相对较高，但操作较为繁琐，耗时长；介孔纳米磁珠法成本相对略高，但操作简单，耗时短，为血浆游离DNA的提取提供方法基础。2、建立了一种在保留cfDNA片段完整性的同时选择性扩增孕妇血浆中小于300bp的DNA片段的方法，实现了在富集cffDNA的同时进行大量扩增，大大降低母体血浆中游离DNA背景干扰，为利用孕妇血浆中cffDNA进行无创性产前检测奠定了实验基础。3、评价了6种常用的内参基因分别在孕妇血浆DNA、非孕女性血浆DNA以及孕妇血浆中不同长度的DNA片段之间的含量稳定性，证明了在血浆游离DNA中，内参基因的含量稳定性具有显著的差异，在孕妇与非孕妇整体组、孕妇组、非孕妇组、母体与胎儿整体组、母源DNA组、胎源DNA组中，含量稳定性最高的基因分别为TERT、ACTB、ALB、HBB、HBB、GAPDH，为利用孕妇血浆DNA进行的相对定量分子生物学实验提供理论依据。4、应用改进的AFLP技术以及qPCR技术，建立了一种诊断时间早、准确率高、风险低、价格低廉的21-三体综合征检测方法，为多种染色体倍体疾病以及单基因遗传病的同步筛查等高通量无创产前检测奠定了方法基础。本研究应用接头连接技术，在保留cffDNA片段完整性的基础上高效选择性扩增孕妇血浆中痕量的cffDNA分子，有效降低母体血浆中游离DNA背景干扰，突破应用cffDNA进行无创性产前检测检材获取困难的限制，并且在此基础上建立了一种基于AFLP技术诊断21-三体综合征的新方法。该方法具有诊断时间早、准确率高、风险低、价格低廉等特点。利用这一技术还可实现多种染色体倍体疾病以及单基因遗传病的同步筛查等高通量无创产前检测。