组织蛋白酶L与人腰椎间盘退变关系的研究前言人类椎间盘退变开始很早，并且是引起后背痛和神经并发症的最主要的原因。但关于椎间盘退变的病理过程我们还知之甚少。最近研究表明蛋白水解酶在椎间盘组织的破坏过程中起作用。除基质金属蛋白酶（MMPs）外，组织蛋白酶（Cathepsins）也是能够降解胶原和粘蛋白的蛋白水解酶。已有研究表明Cathepsins在骨性关节炎和类风湿关节炎的关节软骨的破坏过程中起作用。然而，关于Cathepsins在椎间盘退变中的作用的研究还较少。本次试验采用免疫组织化学S-P法和逆转录—聚合酶链式反应（RT-PCR）法检测人腰椎间盘细胞Cathepsin L蛋白表达，研究Cathepsin L与人腰椎间盘退变的关系。实验对象实验所用间盘取自术中（2005年1月至2005年12月在中国医科大学附属第一医院骨科手术治疗的患者），退变组25例（腰椎间盘突出症患者，男11例，女14例，23～68岁。）；并根据术中所见将腰间盘突出分为非包含型组（11例）和包含型组（14例）；对照组间盘5例（胸腰段骨折行前路手术患者，取手术中切除的间盘组织，并经MRI T2加权间盘信号改变程度验证其为正常间盘，男3例，女2例，21～32岁）。实验方法一、HE染色组织学观察4μm石蜡切片经脱蜡至水，苏木素浸染10分钟，蒸馏水15分钟，而后伊红染色数秒钟，显微镜下观察。二、免疫组织化学S—P法检测椎间盘细胞Cathepsin L的蛋白表达4μm石蜡切片脱蜡至水；用体积分数3％的H₂O₂室温孵育10分钟，封闭内源性过氧化氢酶；P B S浸泡冲洗3次，每次4分钟；5％正常山羊血清室温孵育20分钟封闭非特异性染色；滴加兔抗人Cathepsin L单克隆抗体适量，4℃过夜；P B S浸泡冲洗3次，每次4分钟，滴加生物素化山羊抗兔IgG 37℃20min；DA B显色，麦氏苏木素轻度复染，封片后显微镜观察。三、逆转录—聚合酶链式反应（R T—P C R）检测Cathepsin L基因mRNA转录水平美国Medline国立图书馆基因库检索基因，应用电脑软件primer 5.0版自行设计Cathepsin L引物，北京三搏远志生物技术有限公司合成。上游：5′-CAA CCAAGG CTT TGA GAT-3′；下游：5′-TCC AAG GGA GTG TTC AGG-3′。Cathepsin L预计扩增片段为366bp，并选用β肌动蛋白（β—actin）为参照物，半定量检测Cathepsin L基因转录水平。（1）提取总R N A。（2）R N A含量及纯度测定。（3）逆转录反应合成cDNA，反应条件为：65℃1min→30℃5min→15-30min内匀速升温至65℃→65℃30min→98℃5min→5℃5min。（4）P C R反应扩增，反应条件为：①94℃3 min→②84℃45sec→③56.7℃1min→④72℃1min→⑤72℃7min②-④循环35次。（5）P C R产物于2％琼脂凝胶电泳，Kodak电泳凝胶图像分析系统下观察、摄像及扫描分析。以Catepsin L基因条带的吸光度容积与β—actin条带的吸光度容积的比值作为目的基因的mRNA的相对含量。四、统计分析利用SPSS 10.0 For Windows统计软件进行χ²检验及t检验，比较退变组和对照组、非包含型组和包含型组样本间盘细胞Cathepsin L阳性率及CathepsinL基因mRNA转录水平差异是否有统计学意义。实验结果一、HE染色组织学观察在退变组间盘中，各标本均表现出一定的退变特征：纤维环原有的板层结构紊乱，细胞数量减少，失去原有软骨细胞形态，常有多个细胞被晕轮环绕，部分细胞浆成分极少。二、免疫组织化学S—P法检测椎间盘细胞Cathepsin L的蛋白表达Cathepsin L阳性染色定位于细胞浆。在对照组间盘中，多数样本CathepsinL阳性细胞率低；但是个别样本阳性细胞率较高。在退变间盘中，多数样本Cathepsin L阳性率较高，但也有个别样本阳性细胞率较低，在非包含型组与包含型组相比有较高的Cathepsin L阳性细胞率。三、逆转录—聚合酶链式反应（R T—P C R）检测Cathepsin L基因mRNA转录水平Cathepsin L基因mRNA转录水平在对照组中均较低；退变组中均有较强表达。在非包含型组比包含型组亦有较高的转录水平。四、统计分析结果退变组间盘细胞Cathepsin L阳性率及其基因mRNA转录水平高于对照组、非包含型组高于包含型组。χ²检验及t检验分析证实组间差异有统计学意义（P＜0.01）。讨论椎间盘退变已经被公认为是引起脊柱退行性变的主要原因，伴随年龄增大所引起的椎间盘老化或退变可能是基质合成和破坏之间不平衡所引起的。最近的研究结果表明蛋白水解酶在椎间盘组织的破坏过程中起作用。并且最近研究证实了MMP—3和胶原酶在退变的椎间盘组织中的表达。并且除MMPs外，Cathepsins也是能够降解胶原和粘蛋白的蛋白水解酶。有研究表明Cathepsins在骨性关节炎和类风湿关节炎所致的关节软骨的破坏过程中起作用。关节软骨的化学组成、结构及生物学特性与椎间盘非常类似，因此推想Cathepsins也可能在椎间盘退变的病理过程中发挥作用。在本实验中，多数退变腰椎间盘中CATL表达阳性率高，且退变组间盘CATL基因mRNA转录水平比正常组间盘高，为证明CATL参与间盘退变提供了直接证据。实验表明Cathepsin L能降解Ⅰ型和Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、和连结蛋白这些间盘细胞外基质成份，从而在间盘的退变过程中发挥着重要的作用。CATL和MMPs间一个显著差别是它们的最适PH值不同。MMPs近中性，而CATL则为偏酸性。椎间盘是人体内最大的无血运组织，细胞分裂极不活跃，被动扩散营养方式使椎间盘的中央区营养差，并伴有低氧损伤。无氧代谢产生的乳酸造成内部的低PH环境，体内试验证实退变间盘内的PH值介于5.7-6.3。这不仅损害了细胞的新陈代谢，影响细胞的生物合成功能，还为CATL发挥细胞外蛋白水解酶作用、降解细胞外基质提供了适宜条件。间盘退变的实质是椎间盘细胞外基质的改变及基质与细胞粘附功能减退导致的细胞凋亡。在扩张型心肌病的研究中发现：Cathepsin L通过坏死和凋亡引起大量心肌细胞死亡后，心室进行重塑，最后导致扩张型心肌病。在椎间盘的增龄性改变中发生的凋亡过程可能也有CATL的参与。尽管我们的结果表明在椎间盘退变过程中有Cathepsin L的表达上调，然而Cathepsin L的调节机制尚不清楚。据报告炎性细胞因子和生长因子是CathepsinL合成的调节因子，这些因子可能是外来的也可能是椎间盘细胞自己合成的，都与Cathepsin L的调控密切相关，这些还有待于进一步的阐明。综上所述Cathepsin L参与了人腰椎间盘退变的病理过程，但是其作用机制还有待于进一步研究，另外Cathepsin L的调节机制尚还不清楚。并且在本次实验中的部分正常间盘中Cathepsin L的表达也提示了Cathepsin L在参与间盘退变的病理改变时可能还具有其它的生物活性。结论Cathepsin L与人腰椎间盘退变有关。