研究背景:近年来,男性骨质疏松(osteoporosis,OP)患病率和OP相关性骨折的风险逐年增加。然而大型的流行病学研究、临床及动物实验多集中在老年女性、去卵巢动物模型,对高脂饮食诱导的肥胖男性骨代谢的研究相对较少。OP的发生与遗传、年龄、雌激素缺乏、钙磷代谢异常以及环境因素有关,在环境因素中,饮食因素是重要的组成部分。最近的几个研究指出,不管是从临床流行病学观察,还是动物实验,高脂饮食对骨代谢有负性影响。一项针对中老年人的人群研究显示随着年龄增长,高的体脂成分是OP的危险因素。多项动物实验显示高脂摄入能导致骨强度降低,小梁骨骨微结构损害。我们课题组的前期实验结果表明,不管是高脂饮食(60%脂肪)还是高胆固醇(2%)饮食,均可导致骨小梁结构损害,骨的生物力学指标下降。营养对维持骨骼健康有重要作用,通过研究饮食结构对骨代谢的影响有助于为OP的防控提供理论依据。ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 polyunsaturated fatty acid,ω-3 FA)是人体必需脂肪酸,常存在于鱼油、亚麻籽油、紫草油中,主要包括 α-亚麻酸(α-linolenic,ALA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA),它们能减轻脂代谢紊乱、降低炎症因子、抗动脉粥样硬化、改善血管内皮功能异常,对心脑血管有保护作用。近年的研究发现增加饮食中ω-3 FA的摄入对骨代谢有益。ALA是植物来源的亚麻籽油(Flaxseed oil,FO)、紫草油中的主要成分,相比于DHA和EPA,其价廉易得。FO含有接近60%的ALA,是植物来源的ω-3 FA的一种典型代表。然而,ALA对不同的实验动物模型骨代谢的影响研究结果是不一致的。一项临床研究发现,每日补充6克FO能降低血液透析病人的骨吸收。动物实验发现,大鼠出生后食用含亚麻籽粉的面粉,有助于改善成长期大鼠的骨质量。然而另有动物实验研究表明,给予成长期的小鼠喂养1 0%的FO与10%的玉米油相比,对小鼠的骨量和骨强度无影响。FO对高脂诱导的骨损害是否具有改善作用,国内外未见报道。因此,本研究设计动物实验观察FO替代高脂(60%脂肪)中的部分猪油和全部豆油,观察其是否能改善高脂饮食诱导的雄性SD大鼠骨损害。FO发挥骨保护作用的具体机制,目前研究尚不明确。体外实验ω-3 FA对骨代谢机制的研究大部分集中于ωo-3 FA对破骨细胞(osteoclasts,OCs)的抑制作用,对成骨细胞(osteoblasts,OBs)的研究较少,且研究结果是不一致的,存在争议。因此,我们提取大鼠原代OBs,应用棕榈酸(palmitic acid,PA)模拟体内高脂状态,在有或者无PA存在情况下,应用不同浓度的ALA处理原代OBs,观察其对OBs的ALP活性、成骨相关基因和蛋白(β-catenin、RUNX2、osterix)表达的影响,试图明确ALA骨保护作用的机制。目的:1、明确高脂饮食对雄性SD大鼠骨密度、骨生物力学、骨微结构、骨形成标志物、骨吸收标志物的影响。2、通过FO替代高脂饮食中的部分成分,观察FO对高脂饮食诱导的骨损害是否具有保护作用。3.应用ALA或PA+ALA干预大鼠原代OBs,明确ALA发挥骨保护作用的机制。研究方法:1、4周龄雄性SD大鼠40只,适应性喂养1周后,随机分成普食组NC(10%脂肪)、普食加FO组NY(10%FO)、高脂组HFD(60%脂肪)、高脂加FO组HY(用10%FO替代部分成分),动态观察不同饮食成分对SD大鼠各阶段12周(青年期)、22周(成年期)体成分和骨密度的影响;干预12周时给予大鼠活体抽血,室温离心血清,检测各组骨形成标志物1型原胶原N端前肽(P1NP)、碱性磷酸酶(ALP)和骨吸收标志物1型胶原C末端肽(CTX-1)水平。干预22周,完成体成分和骨密度检查后,大鼠饥饿12小时后麻醉取血并处死大鼠,室温离心取血清,用于检测PINP、ALP以及CTX-1;取左侧股骨行三点弯曲实验,观察骨强度变化;右侧股骨行microCT检查,观察骨微结构变化;左侧胫骨行HE染色,观察骨小梁数目和脂肪细胞数目。2、应用酶消化法、差速贴壁法提取原代OBs,并应用ALP染色和核固红复染鉴定细胞是否为OBs,采用ALP染色,观察ALA和PA对早期成骨功能的影响,分别采用Real time-qPCR和Western Blotting检测成骨相关基因和蛋白(β-catenin、RUNX2、osterix)的表达变化。结果:1、FO能降低高脂饮食诱导的雄性SD大鼠体重,减少全身和腹部脂肪堆积,提高脊柱骨骨密度,但对全身骨密度和股骨骨密度无影响不同饮食干预12周后,HY组与HFD组比较,能改善高脂饮食导致的雄性SD大鼠体重增加,降低高脂饮食所致体脂成分增加,提示FO能降低体重,改善高脂饮食所致全身及腹部脂肪堆积。不同饮食干预12周,不管是否校正体重,四组之间全身骨密度、股骨骨密度以及脊柱骨密度均无统计学差异。干预22周后,HY组与HFD组比较,HY组对高脂饮食导致的体重增加、体成分影响持续存在。校正体重影响,不同饮食干预22周,HY组与HFD组比较,能改善高脂饮食所致脊柱骨骨密度下降(P<0.05),但全身骨密度及股骨骨密度四组比较无统计学差异。2、FO对骨形成标志物P1NP、ALP和骨吸收标志物CTX-1的影响不同饮食干预12周,对骨形成标志物P1NP、ALP无影响,HFD组与NC组相比,干预12周骨吸收标志物CTX-1增加(P<0.01),HY组与HFD组比较,能降低高脂饮食所致CTX-1增加(P<0.01)。干预22周后,HFD组与NC组相比,P1NP、ALP降低(均P<0.01),CTX-1增加(P<0.01),HY组与HFD组比较,能改善高脂饮食所致P1NP(P<0.01)、ALP(P<0.05)的下降,且能降低高脂饮食所致CTX-1增加(P<0.01)。NC组与NY组比较,在12周、22周测定上述血清学标志物,不管是P1NP、ALP,还是CTX-1,均无统计学差异。3、FO改善高脂饮食诱导的雄性SD大鼠骨生物力学损害与NC组相比,HFD组最大负荷、最大断裂负荷、最大拉伸强度、韧性、弹性模量、能量吸收均降低(P<0.01或0.05),NY组与NC组比较,上述指标均无统计学差异:与HFD组比较,HY组最大负荷、最大断裂负荷、最大拉伸强度均增加(P<0.01或0.05),韧性、弹性模量、能量吸收有所改善,但差异无统计学意义。4、FO改善高脂饮食对雄性SD大鼠小梁骨骨微结构的破坏同三点弯曲试验结果一致,与NC组相比,HFD组小梁骨结构参数如小梁骨体积骨密度(Tb.vBMD)、小梁骨体积与骨总体积比(Tb.BV/TV)、小梁骨数目(Tb.N)、小梁骨厚度(Tb.Th)明显下降(P<0.01或0.05),骨小梁分离度(Tb.Sp)和结果模型指数(SMI)明显升高(P<0.01或0.05),与HFD组比较,HY组上述所有指标明显改善(P<0.01或0.05)。然而,NY组与NC组相比,小梁骨结构参数无明显变化。同样地,皮质骨结构参数如皮质骨体积骨密度(Ct.vBMD)、皮质骨体积与骨总体积比(Ct.BV/TV)、皮质骨厚度(Ct.Th)四组比较无统计学差异。5、FO增加骨小梁数目,降低脂肪细胞数目胫骨HE染色结果说明,不同饮食干预22周后,与NC组比较,HFD组骨小梁数目减少,脂肪细胞数目增加(均P<0.01);与HFD组比较,HY组骨小梁数目增多,脂肪细胞数目减少(均P<0.01);然而,NY组与NC组比较,骨小梁数目与脂肪细胞数目均无明显差异。6、单用ALA对原代OBs的ALP染色活性无影响,但ALA能改善PA对ALP染色活性的抑制作用应用不同浓度的ALA处理OBs 5天,与对照组相比,ALP染色无明显变化。PA0.2mM干预OBs 5天,与对照组相比,ALP染色活性明显降低,提示PA0.2mM能抑制OBs的早期成骨功能,同时应用PA0.2mM和不同浓度的ALA干预OBs 5天,ALA能以浓度依赖性方式缓解PA对ALP染色活性的抑制作用。7、ALA能促进成骨相关基因和蛋白(β-catenin RUNX2、osterix)的表达,PA抑制上述基因和蛋白的表达,ALA可改善PA对成骨相关基因和蛋白的抑制作用RT-qPCR和Western blotting结果显示,应用不同浓度的ALA处理OBs 3天,与对照组相比,成骨相关基因和蛋白(β-catenin、RUNX2、osterix)表达增加,提示ALA能通过促进成骨相关基因和蛋白表达,促进OBs分化;与ALP染色结果一致,PA0.2mM干预OBs 3天,与对照组相比,成骨相关基因和蛋白表达明显降低(均p<0.0001),同时应用PA0.2mM和不同浓度的ALA干预OBs 3天,ALA能以浓度依赖性方式减轻PA对成骨相关基因和蛋白的抑制作用(均p<0.01)。结论:1、高脂饮食能增加体重,增加全身及腹部脂肪堆积。高脂饮食能降低骨形成标志物,增加骨吸收标志物,降低骨强度,破坏骨小梁结构,增加骨髓脂肪细胞数目,但对皮质骨骨密度、皮质骨微观结构参数无明显影响。2、FO替代高脂饮食中部分成分,可降低体重,减少全身脂肪和腹部脂肪堆积,增加骨形成标志物,降低骨吸收标志物,改善骨强度,改善小梁骨结构参数,降低骨髓脂肪细胞数目。因此,FO可能作为一种潜在的治疗物质用于治疗高脂诱导的骨损害。3、FO发挥骨保护作用的机制可能是通过其活性成分ALA改善ALP活性、促进成骨相关基因和蛋白(β-catenin、RUNX2、osterix)的表达起作用。