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植物生长发育过程中会遭受多种(非)生物胁迫的影响,苹果作为重要的经济树种,因其遗传背景相对复杂、杂和度高、生长周期较长等问题在短时间内难以通过常规的育种工作在短时间内获得抗逆、抗病等品质优良的新品种。近年来,随着苹果基因组的测序工作的完成以及现代生物技术的快速发展,为我们解决育种难题提供了新思路。 茉莉酸(JA)及其挥发性甲酯衍生物茉莉酸甲酯(MeJA)和氨基酸衍生物统称为茉莉酸类物质(JAs),是植物体内起整体调控作用的植物生长调节物质。JAs的生理效应,一方面与植物的生长发育相关,另一方面与自身的防御系统相关,可诱导一系列植物防御基因的表达、防御反应化学物质的合成等,并调节植物的“免疫”和应激反应。茉莉酸合成途径的激活对于应激信号的传递和放大是必不可少的,丙二烯氧化物环化酶(AOC;EC5.3.99.6)是茉莉酸生物合成途径中的关键酶。AOC酶的催化作用对于茉莉酸的合成至关重要。研究AOC对于提高植物的抗逆性及抗病性的作用具有重要意义。本研究通过将苹果MdAOC1转入烟草中探索苹果MdAOC1在提高植物抗逆性和抗病性中的作用,为在苹果育种遗传改良中的应用奠定基础。 利用本实验室从苹果中克隆鉴定的一个 AOC基因,命名为 MdAOC1,构建了该基因的真核表达载体,并通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草,经过 PCR和Western blot验证,获得转基因阳性株系。为了进一步探究MdAOC1基因的功能,选取4个转基因株系通过盐胁迫、低温胁迫以及烟草疫霉侵染处理。主要研究结果如下: (1)将MdAOC1的编码区连入pCAMBIA1300载体,构建了MdAOC1的过表达载体。利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,获得转基因植株,并通过PCR、qRT-PCR以及Western杂交的方法检测具有潮霉素抗性的转基因植株,获得了MdAOC1过表达转基因烟草。 (2)正常生长条件下,转基因株系和野生型烟草表型以及叶片内源茉莉酸甲酯的水平无明显差异,但是在盐胁迫和低温胁迫条件下,转基因烟草与野生型烟草相比,能维持较好的表型,电解质外渗率,MDA含量较低,茉莉酸甲酯含量较高,说明过表达MdAOC1基因提高了烟草植株的抗逆能力。 (3)经低温胁迫和盐胁迫处理,转基因烟草较野生型烟草能维持较高的SOD、POD、CAT活性。qRT-PCR分析结果显示, MdAOC1基因的过表达提高了抗盐相关基因NtDREB1a、NtDREB2、NtP5CS、NtNXH1和抗低温相关基因NtCBF1、NtCBF2、NtCBF3、NtICE1的表达,从而提高转基因烟草的抗低温和抗盐能力。 (4)通过烟草疫霉侵染烟草,观察烟草黑胫病的发病情况,测定病程相关基因NtPR1a、NtPR1b、Nthrs203J和NtGST的相对表达量、茉莉酸甲酯的含量,结果显示MdAOC1基因的过表达延缓了转基因烟草的发病时间,降低了转基因烟草发病程度,提高了转基因烟草的抗病性。 本研究表明转苹果MdAOC1基因的烟草提高了抗盐、抗低温、抗黑胫病能力,推测该基因在提高植物抗逆性方面具有重要作用。