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果聚糖(Fructan)广泛存在于温带、亚温带草本及禾本植物中,能提高植物对干旱、盐碱和低温等非生物胁迫的抗性。异源六倍体小麦是重要的粮食作物,果聚糖合成和降解是小麦碳水化合物的主要代谢途径之一。研究小麦中果聚糖合成酶(Fructan biosynthesis enzymes, FBEs)基因结构特性、表达特性、遗传特性和功能,解析果聚糖合成相关基因与抗逆性之间的关系等,对认识小麦的进化过程、明晰果聚糖合成酶基因参与抗旱的机理及通过转基因方法提高小麦等作物的抗逆性具有重要意义。本研究以二倍体乌拉尔图小麦(AA)、西尔斯山羊草(SS)、粗山羊草(DD),四倍体硬粒小麦(AABB),六倍体普通小麦(AABBDD)等小麦族植物为材料,利用Touch-down PCR技术分离出果聚糖合成酶基因蔗糖:蔗糖-1-果糖基转移酶( Sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase, 1-SST)、果聚糖:果聚糖-1-果糖基转移酶(Fructan: fructan1-fructosyltransferase, 1-FFT)和蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(Sucrose: fructan 6-fructosyltransferase, 6-SFT),进行了基因结构和序列分析;以普通小麦品种扬麦6号为材料,采用I-PCR及TAIL-PCR技术,分别克隆了三个果聚糖合成酶基因的启动子序列,利用生物信息学技术对克隆的启动子功能元件进行了预测,通过功能元件缺失的方式构建功能缺失融合载体,运用基因枪轰击小麦幼胚,通过GUS基因瞬时表达进行启动子的功能研究;利用Southern杂交分析了三个果聚糖合成酶基因在不同倍性小麦族植物的拷贝数。利用绿色荧光蛋白(GFP)和6-SFT基因构建融合表达载体,轰击洋葱表皮细胞,对6-SFT进行了亚细胞定位分析;以6个普通小麦品种为材料,采用Real-time技术分析了在不同干旱胁迫时期果聚糖合成酶基因的表达模式。利用农杆菌介导法将克隆的小麦6-SFT基因转入了烟草,对转基因烟草植株进行了抗旱、抗盐和抗低温鉴定。主要结果如下:1.小麦族植物中1-SST基因序列比较保守。gDNA长度为3326 bp,cDNA大小为1989 bp,由4个外显子和3个内含子构成,4个外显子大小依次为406 bp、9 bp、872 bp、702 bp,3个内含子大小分别为161 bp、146 bp、1030 bp。小麦族植物中的1-SST基因都含有一个只有9个核酸序列(ATCCCAACG)组成的小外显子,是目前植物中发现的最小的外显子。在氨基酸水平上,AABB同AA和SS的序列相似性分别为95.62%和96.83%。AABBDD同AA、SS和DD的相似性分别为97.89%、99.09%和99.24%;2.小麦族植物中的1-FFT基因大小在AA、SS、AABB、AABBDD基因组上都为2652 bp, cDNA大小均为1947 bp,由4个外显子和3个内含子构成,4个外显子大小分别为367 bp、9 bp、869 bp和702 bp,3个内含子大小分别为156 bp、377 bp和172 bp。在DD基因组上gDNA序列长度是2603 bp,cDNA大小为1935 bp,4个外显子大小分别为355 bp、9 bp、869 bp和699 bp,3个内含子大小分别为160 bp、393 bp和118 bp。1-FFT基因也有一个只含有9个碱基(ATCCCAACG)的外显子序列。在氨基酸水平上,AABB同AA和SS的序列相似性分别为97.84%和99.38%。AABBDD同AA、SS和DD的相似性分别为99.07%、99.07%和88.63%。3.小麦族植物6-SFT基因在进化上比较活跃。其gDNA在AA、SS、DD、AABB和AABBDD基因组中分别为3122 bp、3302 bp、3100 bp、3138 bp和3146 bp,cDNA大小同为1851 bp。与1-SST和1-FFT基因相同,6-SFT也含有4个外显子和3个内含子。在第一个外显子上出现了插入/缺失突变,它们的gDNA长度主要差异在第三个内含子上。在氨基酸水平上,AABB同AA和SS的序列相似性分别为97.08%和98.54%。AABBDD同AA、SS和DD在DNA序列上的相似性分别为97.24%、98.70%和96.92%。4.明确了果聚糖合成酶基因在不同倍性小麦族植物中的拷贝数。1-SST基因在AA基因组和DD组中存在3个拷贝,在SS基因组中至少有1个拷贝,在AABB基因组中有5～6个拷贝,在AABBDD基因组中至少含有7～8个拷贝;1-FFT基因在SS和DD基因组中存在3个拷贝,在AA基因组中至少存在2个拷贝,在四倍体AABB基因组中有6个拷贝,在普通小麦AABBDD基因组中至少有7个拷贝出现;6-SFT基因在AA基因组中有2～3个拷贝,在SS基因组中至少有1个拷贝,在DD基因组中存在3个拷贝,在AABB中有5～6个拷贝,在AABBDD中至少存在7～8个拷贝。5.成功从小麦基因组中克隆了3个果聚糖合成酶基因启动子区段,命名为PSFT、PSST及PFFT,长度分别为1064 bp、1927 bp及2142 bp。功能元件预测结果表明,3个启动子区段皆有完整的TATA盒及CAAT元件,同时也具有逆境胁迫响应的元件,如MYB、LTR、ABRE及GARE,同时也存在控制生长昼夜节律性变化的Circadian元件及胚乳特异表达的Skn-1元件(PFFT除外)。对1-SST及1-FFT启动子进行了功能元件缺失研究表明它们受胁迫诱导。6.明确了果聚糖合成酶基因在不同干旱胁迫阶段的表达特性。1-SST和1-FFT基因在干旱胁迫7天时表达量达到最高,6-SFT在干旱胁迫26天时表达量达到最高。进一步分析表明,不同小麦材料果聚糖合成酶基因具有有不同的表达特性,1-SST基因在扬麦6号中表达量最大,其次是扬麦12,而在整个干旱胁迫处理过程中中国春的表达量基本保持在同一水平,表达量较低,这也许是中国春不耐旱的原因之一。1-FFT的表达模式和1-SST相似,只是在胁迫处理到第7天时,旱选10号的表达量最高。6-SFT对干旱胁迫的响应要慢于1-SST和1-FFT,也是旱选10号的表达量最高。7.利用GFP的瞬时表达进行6-SFT基因亚细胞定位分析,构建了融合表达载体16318-hGFP::6-SFT,借助基因枪转化技术转化洋葱表皮细胞,获得在洋葱表皮细胞中融合表达的GFP及6-SFT,共聚焦显微镜观测表明6-SFT基因定位在洋葱表皮细胞质膜上。8.利用烟草这种模式植物进行6-SFT抗逆功能分析,获得了转小麦6-SFT基因的烟草。通过对转基因烟草株系的旱胁迫、盐胁迫和低温胁迫试验,相对于未转基因的野生型对照来说,转基因烟草表现出较强的抗旱、抗盐和抗低温能力。