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目的CD8+T细胞在抗人类免疫缺陷病毒（human immuno-deficiency virus,HIV）感染过程中起着关键作用,其中na（?）ve CD8+T细胞没有接受过抗原刺激,对人体产生针对新抗原的免疫应答非常重要,受抗原刺激后,能迅速活化、增殖,并分化为细胞毒性T细胞。Memory CD8+T细胞对机体产生快速二次免疫应答和维持机体免疫平衡具有重要作用,依据表型不同,外周血memory CD8+T细胞主要分为三个亚型:中央型(TCM)和两个效应型(TEM-1和TEM-2),接受刺激后,TCM缺少效应功能,但能有效地刺激树突状细胞递呈抗原,并能快速增殖,分化为效应型T细胞;而TEM能产生效应分子IL-4、IFN-γ和TNF-α,且含有穿孔素,具有细胞毒性,能迅速杀伤感染细胞,介导炎症反应。国外研究报道,在CD8+TEM的两个亚型中,TEM-2型表达的穿孔素最多,对β-趋化因子的趋化活性最强,且具有增殖活性。目前,有关na（?）ve和memory CDS+T细胞,尤其是TEM-2型CD8+T细胞在HIV感染者体内的动态变化、免疫作用机制及在抗病毒治疗、疫苗研制中的作用尚不明确,HIV感染长期不进展者的系统报道甚少,尚无中国HIV感染者及HAART治疗患者不同亚群memory T细胞的研究。以往多以CD45RA和CD62L作为标志测定na（?）ve、memory T细胞数量,本课题在此基础上,应用多色流式细胞仪,运用多参数（CD45RA、CCR7、CD28）进一步明确定义na（?）ve、memory T细胞及其不同亚群,研究不同疾病进展阶段的中国HIV感染者na（?）ve、memory T细胞数量变化及其活化、增殖、受体表达情况,并探讨这些指标与疾病进展及免疫功能的相关性。方法1、研究对象:58例未经抗病毒治疗的HIV/AIDS患者来自中国辽宁、吉林和河南,其中男性28例,女性30例,年龄分布为30-68岁（40.7±9.2）。根据HIV感染时间和CD4+T细胞数量将上述患者分为HIV感染长期不进展组（long-termnonprogressors,LTNP;感染时间大于10年,CD4+T细胞>500个/μl）、典型进展HIV组（感染时间>5年,CD4+T细胞介于200-500个/μl之间,无艾滋病指征性疾病）和典型进展AIDS组（感染时间>5年,CD4+T细胞<200个/μl或出现艾滋病指征性疾病）。58例HIV/AIDS患者中LTNP 18例、HIV感染者20例、AIDS患者20例。20例健康对照为随机抽取的HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康人,其中男性10名,女性10名。2、T细胞绝对值检测:将20μl CD4FITC/CD8PE/CD3PerCP试剂加入绝对计数管中,经反向加样法加入50μl抗凝血,室温避光15min,加入免洗溶血素450μl,室温避光15min,FACS MultiSET软件检测并进行自动分析,计算CD4+T淋巴细胞绝对值。3、HIV病毒载量检测采用RT-PCR方法,用美国Roche公司的COBAS AMPLICOR自动载量仪测定病毒载量,最低检测范围是400拷贝/ml。4、Na（?）ve、memory CD8+T淋巴细胞数量检测:取HIV-1感染者及健康人全血100μl,应用以下荧光标记的单抗进行染色:CD28-FITC/CD27-PE/CD8-PerCP/CD45RA-APC/CCR7-PE-Cy7/CD4-APC-Cy7,室温孵育30min。加入溶血素3ml,室温孵育8min,1200r/min离心5min,弃上清。加入3ml PBS洗涤两次,加入含1%多聚甲醛的PBS 200μl重悬,FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC、CD8-PerCP、CD45RA-PE-cy7、CCR7-PE-Cy7定义na（?）ve、memory CD8+T细胞,计算这些细胞群的百分比。na（?）ve、memory CD8+T细胞判断标准如下:na（?）ve CD8+T细胞:CD8+CD45RA+CCR7+CD28+memory CD8+T细胞:中央型（TCM）:CD8+CD45RA-CCR7+CD28+效应型:TEM-1:CD45RA-CCR7-CD28+/CD45RA-CCR7-CD28-TEM-2:CD45RA+CCR7-CD28-5、Na（?）ve、memory CD8+T淋巴细胞表面CCR5、CXCR4及CD38水平的检测:取HIV/AIDS患者及健康人全血100μl,应用以下荧光标记的单抗进行染色:CD28-FITC/CCR5-PE/CD8-PerCP/CD45RA-APC/CCR7-PE-Cy7/CD4-APC-Cy7、CD28-FITC/CXCR4-PE/CD8-PerCP/CD45RA-APC/CCR7-PE-Cy7/CD4-APC-Cy7和CD28-FITC/CD38-PE/CD8-PerCP/CD45RA-APC/CCR7-PE-Cy7/CD4-APC-Cy7,室温避光染色30min。加入溶血素3毫升,室温避光10分钟,1200r/min离心5min,弃上清。加入ml PBS洗涤两次,加入1%多聚甲醛的PBS重悬,FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC定义淋巴细胞,分析na（?）ve、memory CD8+T细胞表面CCR5、CXCR4及CD38表达水平。6、CD4+、CD8+T细胞及其亚群内ki67水平检测密度梯度离心法分离HIV-1感染者及健康人PBMC。向流式管1×106 PBMC中加入anti-CD28-FITC、anti-CD8-PerCP、anti-CD45RA-APC、anti-CCR7-PE-cy7和anti-CD4-APC-Cy7各10μl,4℃避光染色25 min,用冷的PBS 2ml洗涤1次（1200r/min离心5min）。应用BD细胞破膜固定试剂盒（BD cytofix/cytoperm kit）,加入500μl Fixation/Permeabilization solution,室温避光20 min,离心弃上清,加入2mlBD Perm/Wash buffer,室温避光10 min,离心弃上清,加入100μl BD Perm/Washbuffer重悬。加入anti-ki67-PE及IgG1-PE同型对照,室温避光30min。2ml BDPerm/Wash buffer洗涤后弃上清,300μl PBS重悬,FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC、CD4-APC-Cy7、CD8-PerCP、CD45RA-PE-cy7、CCR7-PE-Cy7定义na（?）ve、memory CD4+、CD8+T细胞,计算这些细胞群内ki67表达百分比。7、统计学分析:用SPSS13.0软件包对资料进行统计学分析,全部数据用均数±标准差表示。各组间实验指标的比较采用方差分析,各指标间的相关关系采用Spearman秩相关检验,P<0.05为有统计学意义。结果1、Na（?）ve、memory CD8+T细胞数量变化及与疾病进展的关系:通过单细胞水平检测外周血na（?）ve、memory CD8+T细胞水平发现,HIV/AIDS患者与健康对照相比,na（?）ve CD8+T细胞百分比和绝对值均显著减少,memoryCD8+T细胞百分比和绝对值均显著升高（P<0.05）。在memory CD8+T细胞各亚群中,TEM-1百分比显著升高（P<0.05）,TCM、TEM-2百分比和绝对值无显著变化（P>0.05）。LTNP组、HIV组及AIDS组中na（?）ve CD8+T细胞百分比和绝对值均依次下降,AIDS组、HIV组显著低于LTNP组（P<0.05）,memory CD8+T细胞百分比无显著变化,但绝对值依次下降,各组间的下降均有显著性差异（P<0.05）。在memoryCD8+T细胞各亚群中,LTNP组、HIV组及AIDS组TEM-1百分比依次升高,AIDS组显著高于LTNP组（P<0.05）;TEM-2百分比及绝对值依次下降,AIDS组显著低于LTNP组（P<0.05）。LTNP组na（?）ve CD8+T细胞百分比和绝对值与对照组并无显著差异（P>0.05）,但TEM-2及总的memory CD8+T细胞绝对值显著升高（P<0.05）。通过相关性分析发现,Na（?）ve CD8+T细胞与CD4+T细胞显著正相关（P<0.01）,与HIV病毒载量显著负相关（P<0.01）;TCM、TEM-2型CD8+T细胞与CD4+T细胞显著正相关（P<0.01）,但与HIV病毒载量无关（P>0.05）;TEM-1型CD8+T细胞与CD4+T细胞及病毒载量均无关（P>0.05）。2、HAART治疗对na（?）ve、memory CD8+T淋巴细胞亚群的影响:HAART治疗后,HIV/AIDS患者na（?）ve、TEM-2型CD8+T细胞百分比和绝对值均显著升高（P<0.01）,TEM-1型CD8+T细胞百分比显著降低（P<0.01）。3、Na（?）ve、memory CD8+T细胞表面趋化因子受体CCR5、CXCR4表达水平及与疾病进展、T细胞亚群数量的相关性:中国HIV/AIDS患者与健康对照相比,na（?）ve CD8+T细胞表面CCR5表达显著升高（P<0.01）,CXCR4表达显著下降（P<0.01）,memory CD8+T细胞表面CCR5、CXCR4表达均无显著变化（P>0.05）。在LTNP组、HIV组及AIDS组中,na（?）ve、TCM、TEM-1及TEM-2型CD8+T细胞表面CCR5表达均依次升高,HIV组和AIDS组显著高于LTNP组（P<0.01）;na（?）ve CD8+T细胞表面CXCR4表达依次下降,而memory CD8+T细胞各亚群上CXCR4表达却有升高趋势,其中AIDS组TCM、TEM-1型CDS+T细胞上CXCR4表达显著高于LTNP组（P<0.05）,TCM型CD8+T细胞上显著高于HIV组（P<0.05）。LTNP组与健康对照组相比,TCM、TEM-1型CD8+T细胞上CCR5表达显著下降（P<0.05）。相关性分析发现,（1）na（?）ve、TCM及TEM-2型CD8+T细胞表面CCR5表达与CD4+T细胞显著负相关（P<0.05）,TCM型CD8+细胞表面CCR5表达与HIV病毒载量显著正相关（P<0.05）;TEM-1型CD8+T细胞表面CXCR4表达与CD4+T细胞显著正相关（P<0.05）,与HIV病毒载量显著负相关（P<0.05）。（2）Na（?）ve CD8+T细胞数量与其表面CCR5表达的百分率显著负相关（P<0.01）,TEM-2型CDS+T细胞数量与其表面CCR5、CXCR4表达的百分率显著负相关（P<0.05）。4、中国HIV/AIDS患者CD4+、CD8+T淋巴细胞及其亚群增殖、活化及与疾病进展的相关性LTNP组、HIV组及AIDS组中,na（?）ve、memory CD4+、CDS+T细胞亚群内ki67表达均依次升高,AIDS组na（?）ve、TCM、TEM-1型CD4+、CD8+T细胞及TEM-2型CD4+T细胞内ki67表达均显著高于LTNP组（P<0.01）;LTNP组与对照组无显著差异（P>0.05）。从亚群分布看,na（?）ve T细胞ki67表达率约增加2-4倍,memoryT细胞约增加3-5倍。LTNP组、HIV组及AIDS组中,TCM、TEM-1型CD4+T细胞和各CD8+T细胞亚群上CD38表达均依次升高,在AIDS组显著高于LTNP组（P<0.05）;但na（?）ve及TEM-2型CD4+T细胞上CD38表达并无明显变化（P>0.05）。相关性分析发现,CD4+、CD8+T细胞内ki67表达与CD4+T细胞显著负相关（P<0.01）,与HIV病毒载量显著正相关（P<0.01）,与CD4+、CD8+T细胞表面CD38水平显著正相关（P<0.05）。CD4+T细胞与CD8+T细胞之间ki67表达显著正相关（P<0.01）。结论1.中国HIV/AIDS患者na（?）ve CD8+T细胞显著减少,memory CD8+T细胞显著增加,以TEM-1表型为主,TEM-2表型随疾病进展进行性减少。na（?）ve、memoryCD8+T细胞数量与中国HIV/AIDS患者疾病进展显著相关。2.中国LTNP者TEM-2型CD8+T细胞显著高于AIDS患者,而且显著高于健康对照,提示TEM-2型CD8+T细胞对HIV感染后疾病延缓进展具有保护作用。3.HAART治疗使na（?）ve、TCM、TEM-2型CD8+T细胞显著增加,TEM-1型CD8+T细胞显著减少,提示HAART治疗促进AIDS患者的免疫重建。4.中国HIV/AIDS患者na（?）ve、TEM-2型CD8+T细胞上CCR5表达的显著增加与疾病进展中相应na（?）ve、TEM-2型CD8+T细胞数量的显著下降密切相关,提示CD8+T细胞亚群表面高水平CCR5表达可导致其数量下降。5.中国LTNP者CD8+T细胞各亚群表面CCR5表达明显低于HIV感染者和AIDS患者,甚至低于正常人;CXCR4表达亦较正常人有下降趋势,提示趋化因子受体表达的下降有助于维持疾病长期不进展状态。6.中国HIV/AIDS患者T淋巴细胞增殖速度明显加快,且与疾病进展、细胞活化水平密切相关。HIV感染对na（?）ve和memory T细胞增殖的影响程度相似。