研究背景类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）是一种常见的以慢性滑膜炎病变为关键特征的自身免疫性疾病。目前RA的机制尚不清楚,但是炎性因子在RA的发病中至关重要。滑膜巨噬细胞等免疫细胞以及滑膜成纤维细胞释放相应的炎性介质是导致RA滑膜炎症和骨破坏的主要因素。很多证据表明,迷走神经刺激（Vagus nerve stimulation,VNS）能激活胆碱能抗炎通路（Cholinergic anti-inflammatory pathway,CAP）抗炎,从而缓解 RA的滑膜炎症和骨破坏。由于耳甲是迷走神经在哺乳动物体表唯一的分布区,耳穴迷走神经刺激（Transcutaneous Auricular Vagus Nerve Stimulation,taVNS）的抗炎效应很可能是通过刺激耳甲区的迷走神经发挥作用的。鉴于taVNS和VNS有相似的结构基础和功能基础,且已有动物实验与临床研究均表明VNS能够通过CAP缓解RA的滑膜炎症,taVNS的抗炎效应却尚未在RA的疾病模型中得到验证。因此,本文提出taVNS可能通过CAP缓解RA的滑膜炎症的科学假说。研究目的1明确taVNS干预对胶原诱导关节炎（Collagen-induced arthritis,CIA）大鼠关节滑膜炎的缓解效应。2阐明taVNS干预缓解实验性RA关节炎效应与迷走神经完整性的关系。3从外周胆碱能抗炎通路角度探讨taVNS缓解关节炎症效应的细胞内分子机制。研究方法本实验共分成以下四个部分:实验一观察taVNS对脑干孤束核（Nucleus Tractus Solitarius,NTS）与迷走神经背核（dorsal motor nucleus of the vagus,DMV）核团的激活情况;实验二观察taVNS对CIA大鼠滑膜炎症的缓解效应;实验三观察迷走神经切断对taVNS缓解滑膜炎症的效应的影响;实验四观察抑制α7AchR（MLA）对taVNS调节滑膜炎症效应的影响。其中,将实验二分为Control组,CIA组和taVNS组;将实验三分为CIA组,CIA+迷走神经切断（vagotomy,VGX）组和CIA+VGX+taVNS组;将实验四分为CIA组,CIA+甲基牛扁亭柠檬酸盐（Methyllycaconitine citrate,MLA）组,CIA+MLA+taVNS 组。选 1 0 只成年健康雄性SD（Sprague Dawley）大鼠（180±20 g）作为Control组,余下各组均已造模,每组10只,造模成功率为80%。初始免疫4d前,CIA+VGX组和CIA+VGX+taVNS组大鼠在进行造模前行迷走神经切断术预处理,术后恢复4天。CIA大鼠造模成功后,将taVNS组大鼠用异氟烷轻度吸入麻醉,并予以耳甲迷走神经刺激,具体方法为将电子针疗仪正负极连接在两端有电磁铁的铁片上,依靠磁铁吸力固定于大鼠双侧耳甲区,以大鼠耳廓保持连续颤动为基准。刺激参数:连续波,频率20Hz,强度1mA,30min/d,连续28d。治疗时间为上午9～11点。CIA+VGX+taVNS组和CIA+MLA+taVNS组大鼠采用同样的干预方式、频次和时间。CIA+MLA+taVNS组大鼠于taVNS干预前15分钟腹腔注射MLA 3mg/kg行MLA预处理,1次/d,连续干预28天。观察各组大鼠的痛行为学变化、足趾肿胀度变化、关节炎指数变化、组织病理学变化以及滑膜组织蛋白表达水平。采用Vonfrey探测器检测CIA大鼠的足底机械缩足反射阈值（Mechanical Withdrawal Threshold,MWT）,采用 Ugo-37370 型辐射热测痛仪检测足底热痛潜伏期（Thermal Withdrawal Thresholds,TWT）,采用鼠爪肿胀测量仪检测足趾肿胀度（Paw Volume）,并评估关节炎指数（Athritis Index,AI）。采用苏木精-伊红染色法（Hematoxylin-eosin Staining,HE）染色观察CIA大鼠滑膜炎症的病理学变化,采用多因子试剂盒（MesoScaleDiscovery,MSD）检测CIA大鼠血清中肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）和白细胞介素-1β（Interleukin-1 β,IL-1β）的含量。采用免疫印迹法（Western blotting,WB）检测CIA大鼠α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 Nicotinic Acetylcholine Receptors,α7AchR）,磷酸化核因子κB P65（Phosphorylated nuclear factor kappa B P65,NF-κB p65）,磷酸化核因子κB p-p65（Phosphorylated nuclear factor kappa B p-p65 NF-κB p-p65）和 TNF-α蛋白表达水平。实验结果结果一:观察taVNS对脑干NTS与DMV核团的激活情况以c-Fos蛋白表达的神经元数量为标准。免疫组化结果分析显示,经taVNS干预后,与CIA组大鼠相比,taVNS组大鼠的NTS区的c-Fos阳性神经元以及DMV区的c-Fos和ChAT+共标神经元的激活数量显著增多（P＜0.01,P＜0.05）,由于NTS是脑内迷走神经感觉中枢,DMV则是迷走神经运动中枢,支配迷走传出神经的活动,因此这部分结果说明了 taVNS除了可以激活迷走神经在脑内传入中枢外,还能通过迷走反射激活迷走神经的传出中枢,从而可能激活完整的迷走神经抗炎通路。结果二:taVNS对CIA大鼠滑膜炎症的缓解效应1 taVNS对CIA大鼠关节炎指数与足趾肿胀度的影响1.1 taVNS对CIA大鼠关节炎指数的影响初次免疫后第7天,各组间大鼠关节炎指数的差异无统计学意义。初次免疫后第14天,造模成功的各组CIA大鼠后肢双足关节炎指数＞3分。初次免疫后第14天,CIA组大鼠的双足关节炎指数分值迅速升高至6-8分,显著高于Control组（P＜0.05）。经taVNS干预两周后（即初次免疫后第28天）,与Control组大鼠相比,CIA组大鼠的双足关节炎指数缓慢下降直至干预结束,最终稳定至4-6分（P＞0.05）,提示未经任何干预,CIA大鼠的关节炎指数仍能轻度恢复。经taVNS干预两周后,与CIA组大鼠相比,taVNS组大鼠双足关节炎指数显著下降直至干预结束,最终稳定至2-4分（P＜0.05）,提示taVNS可显著降低CIA大鼠的关节炎指数,显著减轻CIA大鼠关节炎的严重程度。1.2 taVNS对CIA大鼠的足趾肿胀度的影响造模前至初次免疫后第7天,各组间大鼠双侧后肢足趾肿胀度的差异无统计学意义。初次免疫后第14天,CIA组大鼠的双侧后肢足趾肿胀度迅速上升,显著高于Control组（P＜0.05）,并在初次免疫后第21天,CIA组大鼠的双足足趾肿胀度达到峰值。初次免疫后第28天,与Control组相比,CIA组大鼠的双足足趾肿胀度缓慢下降直至干预结束（P＜0.05）,提示未经任何干预,CIA大鼠的足趾肿胀度仍能轻度缓解。经taVNS干预两周后,与CIA组大鼠相比,taVNS组大鼠的双足足趾肿胀度显著下降直至干预结束（P＜0.05）,提示taVNS可显著减轻CIA大鼠的足趾肿胀度。2 taVNS对CIA大鼠MWT和TWT的影响初次免疫后第7天,造模前各组间大鼠的双侧后肢MWT和TWT的差异无统计学意义。初次免疫后第14天,与Control组大鼠相比,CIA组大鼠的MWT和TWT显著下降（P＜0.05）。初次免疫后第28天,与Control组大鼠相比,CIA组大鼠的MWT和TWT缓慢升高直至干预结束（P＜0.05）,提示未经任何干预,CIA组大鼠的MWT和TWT仍能轻度缓解。经taVNS干预两周后,与CIA组相比,taVNS组大鼠MWT和TWT显著升高直至干预结束（P＜0.05）,提示taVNS能显著提高CIA大鼠的MWT和TWT并有效缓解CIA大鼠的关节炎疼痛。3 taVNS对CIA大鼠足趾外观和关节组织形态的影响据外观图可见:Control组大鼠的后肢生长健康,踝关节以及各足趾无红肿改变,活动自如,CIA组大鼠的后肢踝关节以及各足趾红肿明显,甚至僵硬变形,符合RA的特征性改变,taVNS组大鼠后肢红肿明显减轻,活动相对自如。据HE染色可见:Control组大鼠踝关节滑膜结构完整,关节面光滑平整,滑膜细胞排列整齐,无炎症浸润和组织碎片。与Control组大鼠相比,CIA组的大鼠关节腔变窄,关节面粗糙不平,滑膜组织内有大量的炎症细胞浸润。与CIA组大鼠相比,taVNS组大鼠关节滑膜的炎性反应减轻,滑膜层较薄滑膜细胞增生数量减少,提示taVNS能改善CIA大鼠的足趾外观以及关节组织的病理形态。4 taVNS对CIA大鼠血清中相关炎性因子含量变化的影响与Control组大鼠相比,CIA组大鼠血清中TNF-α,IL-6和IL-1β的含量均显著升高（P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05）,提示造模后CIA组大鼠血清中炎性细胞因子含量大量增加;与CIA组相比,taVNS组大鼠血清中TNF-α和IL-6表达量均显著降低（P＜0.01,P＜0.01）,但IL-1β的表达量差异无统计学意义（P＞0.05）,证明taVNS能显著降低CIA大鼠血清中炎性因子的含量。5 taVNS对CIA大鼠滑膜组织中CAP调控相关蛋白表达的影响与Control组大鼠比,CIA组大鼠滑膜组织中α7AchR的表达水平无显著差异（P＞0.05）,但NF-κB p-p65/NF-κB p65、和TNF-α的表达水平显著上调（P＜0.05）,提示造模后CIA大鼠滑膜组织中炎性相关蛋白NF-κB p-p65/NF-κB p65和TNF-α的表达水平升高,滑膜的炎性反应加重。经taVNS干预四周后,与CIA组大鼠相比,taVNS组大鼠滑膜组织中α7AchR表达水平显著上调（P＜0.05）,NF-κB p-p65/NF-κB p65 和TNF-α表达水平显著下调（P＜0.05,P＜0.05）,提示taVNS能显著提高CIA大鼠滑膜组织中CAP调控关键受体α7AchR的蛋白表达水平,从而抑制炎性信号通路NF-κB及下游TNF-α炎性因子的蛋白表达,降低关节滑膜的炎性反应。结果三:taVNS缓解滑膜炎症的效应需要完整的迷走神经1迷走神经切断对taVNS调节CIA大鼠关节炎指数与足趾肿胀度的影响1.1迷走神经切断对taVNS调节CIA大鼠关节炎指数的影响初次免疫第0天至初次免疫后第21天,与CIA组大鼠相比,CIA+VGX组大鼠双足关节炎指数无明显的统计学差异（P＞0.05）。初次免疫后第21天,CIA组和CIA+VGX组大鼠的关节炎指数达到峰值,之后两组双足关节炎指数均缓慢持续下降并最终稳定在4-6分之间（P＞0.05）,提示迷走神经切断术对CIA大鼠模型关节炎症状的外观行为表型本身没有显著的影响。与CIA+VGX组大鼠相比,CIA+VGX+taVNS组大鼠双足关节炎指数呈现出与之类似缓慢下降的趋势且双足关节炎指数都最终稳定在4-6分之间（P＞0.05）,以上实验结果说明,迷走神经切断术后,taVNS对CIA大鼠关节炎指数的缓解效应消失,即taVNS对关节炎指数的缓解效应需要完整的迷走神经参与。1.2迷走神经切断对taVNS调节CIA大鼠的足趾肿胀度的影响初次免疫7天内,与CIA组大鼠相比,CIA+VGX组大鼠双侧后肢足趾肿胀度均呈现缓慢下降的趋势。初次免疫后第7天,CIA+VGX组大鼠和CIA组大鼠双侧后肢足趾肿胀度均显著升高并在初次免疫第21天后达到峰值,之后两组双侧后肢足趾肿胀度均缓慢下降直至干预结束（P＞0.05）,提示迷走神经切断术对CIA大鼠双侧后肢足趾肿胀度无影响。初次免疫后第28天,与CIA+VGX组大鼠相比,CIA+VGX+taVNS组大鼠双侧后肢足趾肿胀度的趋势与之相似,均缓慢下降且两组足趾肿胀度最终约在3-4mL（P＞0.05）,以上实验结果说明,迷走神经切断术后,taVNS对CIA大鼠双侧足趾肿胀度的缓解效应消失,即taVNS对CIA大鼠足趾肿胀度的缓解效应需要完整的迷走神经参与。2迷走神经切断对taVNS调节CIA大鼠MWT和TWT的影响初次免疫后第28天,与CIA组大鼠相比,CIA+VGX组大鼠的MWT和TWT呈现类似趋势,均缓慢升高直至干预结束（P＞0.05）,提示迷走神经切断术对CIA大鼠的MWT和TWT并无影响。初次免疫后第28天,与CIA+VGX组相比,CIA+VGX+taVNS组与之趋势相近,均缓慢升高至最终MWT和TWT约为40-60g（P＞0.05）,提示迷走神经切除术显著逆转了 taVNS对CIA大鼠疼痛的缓解效应,即taVNS对CIA大鼠关节炎疼痛的缓解效应需要完整的迷走神经参与。3迷走神经切断对taVNS调节CIA大鼠足趾外观和关节组织形态的影响据外观图可见:CIA组,CIA+VGX组,CIA+VGX+taVNS组大鼠后肢均呈现皮色紫暗,毛发稀疏,没有光泽的表现,且以上三组大鼠后肢踝关节以及各足趾均呈现中至重度肿胀。据HE染色可见:以上三组大鼠的HE染色结果类似,均出现滑膜组织大量增生,大量炎性细胞浸润和滑膜间隙有组织碎片的病理表现。以上实验结果提示,迷走神经切断术对CIA组大鼠踝关节外观和关节组织形态影响不显著,而迷走神经切断术后,taVNS对CIA大鼠后肢踝关节外观和关节组织形态的缓解效应消失,提示taVNS对CIA大鼠足趾外观和关节组织形态的缓解效应需要完整的迷走神经参与。4迷走神经切断对taVNS调节CIA大鼠血清中相关炎性因子含量变化的影响与CIA组大鼠相比,CIA+VGX组大鼠血清中炎性因子TNF-α,IL-6和IL-1β的含量无显著差异（P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05）;与CIA+VGX组大鼠相比,CIA+VGX+taVNS组大鼠血清中的TNF-α,IL-6和IL-1 β表达量无显著差异（P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05）,以上实验结果说明迷走神经切除术对CIA大鼠的炎性反应无显著影响,而迷走神经切断术后,显著逆转了 taVNS对CIA大鼠血清中炎性因子含量的抑制效应,提示taVNS对CIA大鼠血清中炎性因子的缓解效应需要完整的迷走神经参与。5迷走神经切断对taVNS调节CIA大鼠滑膜组织中CAP调控相关蛋白表达的影响与CIA组大鼠相比,CIA+VGX组大鼠滑膜组织中α7AchR,NF-κB p-p65/NF-κB p65 和 TNF-α的表达水平无显著差异（P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05）;与CIA+VGX组大鼠相比,CIA+VGX+taVNS组大鼠滑膜组织中α7AchR、NF-κB p-p65/NF-κB p65 和 TNF-α的表达水平也无显著差异（P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05）,以上实验结果说明迷走神经切除术对CIA大鼠滑膜组织中α7AchR的表达和以上三种炎症相关蛋白的表达无明显影响,而迷走神经切断术后,显著逆转了 taVNS对CIA大鼠滑膜组织中α7AchR表达的上调作用和对NF-κB p-p65/NF-κB p65表达及下游TNF-α蛋白表达的下调作用,提示taVNS对CIA大鼠滑膜组织中CAP相关蛋白的调节效应需要完整的迷走神经参与。结果四:抑制α7AchR（MLA）对taVNS调节滑膜炎症效应的影响1 MLA对taVNS调节CIA大鼠关节炎指数与足趾肿胀度的影响1.1MLA对taVNS调节CIA大鼠关节炎指数的影响初次免疫后第28天,与CIA组大鼠相比,CIA+MLA组大鼠的双足关节炎指数稍高,之后趋势与之类似,均缓慢下降直至干预结束（P＞0.05）,提示注射MLA对CIA大鼠模型关节炎症状的外观行为表型本身没有显著的影响。初次免疫后第28天,与CIA+MLA组大鼠相比,CIA+MLA+taVNS组大鼠的关节炎指数与之趋势相近,均缓慢下降直至干预结束（P＞0.05）,说明注射MLA后,taVNS对CIA大鼠AI的缓解效应显著消失,由于α7AchR是CAP的关键受体,因此以上实验结果提示taVNS对CIA大鼠关节炎严重程度的缓解效应与CAP的激活有关。1.2 MLA对taVNS调节CIA大鼠的足趾肿胀度的影响初次免疫后第28天,与CIA组大鼠相比,CIA+MLA组大鼠双侧后肢足趾肿胀度稍高,之后两组足趾肿胀度均缓慢下降直至干预结束（P＞0.05）,提示注射MLA能轻度加重CIA大鼠的足趾肿胀度。初次免疫后第28天,与CIA+MLA组大鼠相比,CIA+MLA+taVNS组大鼠的双侧后肢足趾肿胀度呈现与之类似的变化趋势,均缓慢下降并最终稳定在3-4mL（P＞0.05）,以上实验结果说明注射MLA后,taVNS对CIA大鼠双侧后肢足趾肿胀度的缓解效应消失,提示taVNS对CIA大鼠足趾肿胀度的缓解效应与CAP的激活有关。2 MLA对taVNS调节CIA大鼠MWT和TWT的影响初次免疫后第28天,与CIA组大鼠相比,CIA+MLA组大鼠的MWT和TWT呈现类似趋势,均缓慢升高直至干预结束（P＞0.05）,提示注射MLA对CIA大鼠MWT和TWT并无影响。与CIA+MLA组大鼠相比,CIA+MLA+taVNS组大鼠趋势相近,均缓慢升高直至干预结束（P＞0.05）,说明注射MLA后,taVNS对CIA大鼠疼痛的缓解效应明显消失,提示taVNS对CIA大鼠关节炎疼痛的缓解效应与CAP的激活有关。3 MLA对taVNS调节CIA大鼠足趾外观和关节组织形态的影响据外观图可见:CIA组,CIA+MLA组,CIA+MLA+taVNS组大鼠后肢均呈现皮色紫暗,毛发稀疏的表现以及各组大鼠后肢踝关节以及各足趾均为中至重度肿胀。据HE染色显示:以上三组大鼠滑膜组织的病理表现类似,均出现滑膜组织大量增生和有大量炎性细胞浸润等病理表现。以上实验结果提示,MLA对CIA组大鼠后肢踝关节外观和关节组织形态影响不显著,而注射MLA后,taVNS对大鼠后肢踝关节外观和关节组织形态的缓解效应消失,提示taVNS对CIA大鼠足趾外观和关节组织形态的缓解效应与CAP的激活有关。4 MLA对taVNS调节CIA大鼠血清中相关炎性因子含量变化的影响与CIA组大鼠相比,CIA+MLA组大鼠血清中炎性因子TNF-α,IL-6和IL-1β的表达量无明显差异（P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05）;与CIA+MLA组大鼠相比,CIA+MLA+taVNS组大鼠的TNF-α,IL-6和IL-1β表达量无显著差异（P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05）,以上实验结果说明注射MLA对CIA大鼠的炎性反应无显著影响,而注射MLA后,taVNS对CIA大鼠血清中炎性因子含量的抑制作用消失,提示taVNS对CIA大鼠血清中炎性因子含量的抑制效应与CAP的激活有关。5 MLA对taVNS调节CIA大鼠滑膜组织中CAP调节相关蛋白表达的影响与CIA组大鼠相比,CIA+MLA组大鼠滑膜组织中α7AchR,NF-κB p-p65/NF-κB p65,和 TNF-α表达水平无显著差异（P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05）;与CIA+MLA组大鼠相比,CIA+MLA+taVNS组大鼠滑膜组织中α7AchR,NF-κB p-p65/NF-κB p65 和 TNF-α表达水平无显著差异（P＞0.05,P＞0.05,P＞0.05）,以上实验结果提示注射MLA对CIA大鼠滑膜组织中α7AchR的表达和以上三种炎症相关蛋白的表达无明显影响,但注射MLA后,taVNS对α7AchR表达的上调作用和其下游NF-κB p-p65/NF-κB p65蛋白表达及TNF-α炎性因子蛋白表达的抑制作用显著消失,证明taVNS对CIA大鼠关节炎症状的缓解效应与CAP的激活有关。结论taVNS能有效缓解CIA大鼠的关节滑膜炎症状,且此效应依赖于完整的迷走神经和胆碱能抗炎通路的激活。