论文部分内容阅读
目的:人类妊娠涉及一系列精密而又复杂的生理过程,包括早孕期胚胎的植入、基质细胞蜕膜化和胎盘的形成。一直以来,人类不育和流产都是引起广泛重视的全球性社会和经济问题。尽管目前辅助生殖技术的飞速发展为不孕不育者提供了妊娠的机会。但从辅助生殖技术研究中发现,胚胎植入的成功率仍然维持在一个较低的水平。胚胎植入是胚胎在子宫中发育的重要阶段,是在有植入能力的囊胚和建立容受性的子宫之间的相互协调配合下完成,这一过程受到多种细胞因子、生长因子、转录因子和雌孕激素的共同调控。mTOR信号通路作为细胞增殖、生长和存活等的调控中心,其主要成员之一mTORC2对于胚胎植入的作用至今却未见报告。本研究通过构建小鼠早孕期模型,研究mTORC2的主要配体之一—Rictor在小鼠早孕期的表达规律;再通过构建子宫内膜组织条件敲除Rictor基因的动物模型。探究其对胚胎植入的影响,为最终阐明其在胚胎植入以及孕体基因型与环境有害因素相互作用的相关机制奠定基础。方法:1)构建正常小鼠早孕模型,收集怀孕D1、D4至D7天小鼠子宫内,采用免疫组化的方法检测Rictor在小鼠早孕期的表达。2)采用Cre-Loxp重组酶系统,构建子宫内膜条件敲除Rictor基因的动物模型。利用PCR和琼脂糖凝胶电泳对鼠尾提取的DNA进行基因型鉴定;验证敲除鼠模型成功后利用免疫组化检测敲除鼠和正常对照鼠子宫内膜和卵巢中Rictor的表达;Western blot及Real-time PCR检测敲除鼠和正常对照鼠子宫内膜中Rictor的表达。3)收集孕第4天和孕第5天敲除小鼠和正常对照鼠的子宫进行称重并且统计着床点数,利用增殖标志物Ki67和容受性标志物MUC1、Lif和Areg等检测敲除鼠子宫内膜的增殖和容受性。结果:1、免疫组化结果表明,Rictor基因在小鼠早孕期D1至D4表达于腔和腺上皮,以及胚胎植入后着床点附近的蜕膜组织区。2、通过F1代至F6代,成功繁殖了一批基因型为Rictorfl/flCre+/-的条件性敲除小鼠(共88只),基因型为Rictorfl/flCre+/-的对照组小鼠(共170只)。免疫组化、Western blot及RT-qPCR结果表明小鼠子宫中Rictor表达降低,提示Rictor子宫条件敲除小鼠模型构建成功。3、敲除鼠的子宫体积和重量都明显比对照鼠降低(P<0.01);敲除鼠孕5天子宫外观显示无可见胚胎植入位点,且腔上皮细胞中增生标志物Ki67和子宫内膜容受性标志物MUC1、Lif和Areg等表达均出现明显异常。结论:1、早孕模型结果表明rictor可能调控子宫内膜容受性或基质细胞蜕膜化,参与小鼠子宫内膜胚胎植入过程;2、小鼠子宫内膜条件敲除Rictor后,胚胎的植入受阻,植入率明显下降;3、小鼠子宫内膜条件敲除Rictor后,与正常对照组小鼠相比出现容受性缺陷。