藻胆蛋白是蓝藻(cyanophyceae)、红藻(Rhodophyceae)、隐藻(Cryptophyceae)和一些少数甲藻(Pyrrophyceae)中的一种重要的捕光色素蛋白。根据组成和吸收光谱的不同，藻胆蛋白一般分为三类：藻蓝蛋白(Phycocyanin，简称PC，吸收光谱在610-640nm)、藻红蛋白(Phycoerythrin，简称PE，吸收光谱在500-570nm)和别藻蓝蛋白(Allophycocyanin，简称APC，吸收光谱在650-671nm)。这些蛋白不仅可以作为工业原料或者食品添加剂，而且还发现它们对一些疾病具有特殊疗效而受到人们的重视，因此藻胆蛋白广泛应用于食品工业、化学工业、医学诊断、临床医学等。此外由于藻胆蛋白种类多、荧光强、量子产量高，易于同生物素、抗体等一些蛋白质结合，因此藻胆蛋白作为荧光探针越来越受到重视。 目前藻胆蛋白主要从螺旋藻中分离纯化制得。但螺旋藻养殖困难，对其室外大规模培养缺乏系统全面地研究，养殖成本高且价格昂贵，因此从螺旋藻中分离纯化藻胆蛋白不仅成本高、工艺复杂、得率低，而且原料浪费严重，借助基因工程方法生产藻胆蛋白已成为当前所需。 本文研究共包括以下几个方面的内容： (1)极大螺旋藻藻蓝蛋白基因的克隆及其进化分析。研究表明：极大螺旋藻藻蓝蛋白基因全长为1119bp，与钝顶螺旋藻藻蓝蛋白基因的同源性为99％。β亚基基因序列位于α亚基基因序列上游，两者之间通过111bp的基因片段连接，β亚基和α亚基的基因序列全长分别为519bp和489bp，分别编码172和162个氨基酸残基，其密码子显示出非对称性。在β亚基基因序列上游8-11bp处存在可能的核糖体结合位点g-a-g-a，该结合位点和原核生物核糖体通常所用的结合位点g-g-a-a相似，但不相同。在极大螺旋藻藻蓝蛋白内也存在三个生色团结合位点，即α亚基氨基酸Cys84和β亚基氨基酸Cys82和Cys153。第三个生色团结合位点Cys153位于β亚基的羧基端，已经证明这个结合位点是由于该亚基的12个氨基酸残基(146-157)被引进了古老的藻蓝蛋白基因中而产生的。藻蓝蛋白包含许多疏水性氨基酸残基，这些疏水性氨基酸残基在藻蓝蛋白的聚集过程中起着极为重要的作用。藻蓝蛋白的疏水性表明它可能是类囊体膜上的一种疏水蛋 浙江大学博士学位论文 第VI页 白通过复制而产生的。在氨基酸水平上对极大螺旋藻藻蓝蛋白a和p亚基氨基酸 的同源性（H。一。藻蓝蛋白 a亚基和别藻蓝蛋白 a亚基氨基酸同源性（H。、＊。 藻蓝蛋白 p亚基和别藻蓝蛋白 p亚基氨基酸的同源性（HO．p）以及别藻蓝蛋白 a 和 p亚基氨基酸的同源性（H6．＊进行分析比较表明：它们之间存在着一定程度 的同源性，其同源性由高到底的J’匝序依次为：＊乃＞＊o＞＊小p＞＊阶们藻蓝蛋白和 别藻蓝蛋白的氨基酸序列的差异性说明这些蛋白质在藻胆体的能量转移和蛋白 质的聚合过程中行使不同的功能，但不同来源的藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白之间的同 源性也表明在藻类的藻胆蛋白体中，这些蛋白质的能量转移功能必须十分相似。 在极大螺旋藻内部首先产生的是藻蓝蛋白的a亚基，然后才产生p亚基。别藻蓝 蛋白和藻蓝蛋白p亚基之间的相似程度要比藻蓝蛋白a和p亚基以及别藻蓝蛋白 以和p亚基的相似程度要高，这说明导致古老的a型和p型基因产生的基因复制 在该家族蛋白质的进化过程中己经发生很久，p亚基可能是由于a亚基的复制而 产生的。极大螺旋藻藻蓝蛋白内a和卜两个亚基存在一定程度的同源性，但同源 性程度不高也表明它们来源于一个古老基因的复制且分离很久、分别进化。 （）极大螺旋藻藻蓝蛋白基因在巴斯德毕赤酵母菌株 X－33中的表达。首先 根据所克隆的极大螺旋藻藻蓝蛋白基因序列构建了基因克隆载体和表达载体， 然后通过L汇lit将表达载体导入巴斯德毕赤酵母菌株X－33 基因组中，通过 dotblotting，PCR，SDS－PAGE和 western blotting筛选出了能够高效表达外源藻 蓝蛋白基因的巴斯德毕赤酵母工程菌株PC39。 门）对重组巴斯德毕赤酵母工程菌PC39发酵生产藻蓝蛋白的特性进行了 初步研究。研究表明在实验条件下所获得的细胞干重最高为 41．93 g／L，发酵液 中蛋白质的最高含量为 9．5232 g／L，藻蓝蛋白的最高产量为 61．195 mg／L，分泌 到胞外的藻蓝蛋白的最高产量为 24．32 mg／L。