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前言锌指蛋白转录抑制因子(positive regulatory domain zinc finger protein, PRDM)是一个新确认的蛋白序列,是一个有关人类肿瘤形成的转录调节因子家族。尽管PRDM在转录调节中的作用还不十分清楚,但近年来研究显示PRDM家族的成员在细胞分化和恶性变中发挥重要作用,但具体作用尚需细化研究。PRDM 14是PRDM家族的成员之一。本研究采用肺癌组织标本,检测PRDM 14在肺癌组织中的表达水平,及其与临床病理因素的关系,同时检测PRDM 14蛋白在多种肺癌细胞系中的表达,研究PRDM 14与肺癌发生发展的关系。实验材料和方法一、病例和标本70例肺癌组织石蜡标本及7例癌旁肺组织标本用于免疫组化检测,标本来自2000年11月-2006年4月于中国医科大学附属第一医院行肺癌切除手术的患者。患者术前均未接受过放化疗。患者平均年龄59岁(20岁-81岁),其中男性40例,女性30例。肺癌标本根据世界卫生组织2004年的分类标准分为腺癌44例,鳞癌26例；其中高分化13例、中分化40例、低分化17例。40例有淋巴结转移,依据国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的肺癌P-TNM分期标准：Ⅰ期23例,Ⅱ期22例,Ⅲ期25例。42例肺癌及42例癌旁肺组织标本用于western blotting检测,标本来自于中国医科大学附属第一医院行肺癌切除手术的患者。患者术前均未接受过放化疗。其中男性26例,女性16例。肺癌标本根据世界卫生组织2004年的分类标准分为腺癌24例,鳞癌18例；其中高、中分化31例,低分化11例。18例有淋巴结转移。6种肺癌细胞系分别为肺腺癌细胞系A549和SPC、LTE,肺鳞癌细胞系列KUM-LK2(以下简称为LK2),肺大细胞癌细胞系NCI-H460(以下简称为460),肺小细胞癌细胞系NCI-H446(以下简称446)；以正常支气管上皮细胞系(human normal bronchi epithelium, HBE)细胞系为正常对照。HBE细胞用含15%胎牛血清的RPMI-1640培养基,其它细胞都用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基,pH值保持在pH7.2-pH7.4之间,于控制在5%CO2、37℃孵箱内培养。二、试剂PRDM14兔抗人多克隆抗体PRDM14 (ab28638)购自美国Abeam生物技术公司,SP超敏免疫组织化学试剂盒(KIT-9710)和DAB显色试剂盒(DAB-0031)购自福州迈新生物技术公司,Trizol试剂购自美国Invitrogen公司,RPMI-1640购自GIBCO公司。三、方法应用免疫组化SP法检测肺癌组织及癌旁肺组织中PRDM14的表达。染色方法按SP免疫组化试剂盒说明书进行,经柠檬酸(pH=6.0)高温高压修复。每张切片在显微镜(×400)下随机选取10个视野,每个视野计数100个肿瘤细胞,计数其中的阳性细胞数,然后取平均值。染色强度分级为：阴性为0,淡黄色为1,黄棕色为2,深棕色为3。以阳性肿瘤细胞数分级：<5%为0,5%-25%为1,25%-50%为2,>50%为3。利用染色强度与阳性肿瘤细胞数乘积来评定结果,0为阴性,1为弱阳性,2-4为阳性,6-9为强阳性。western blotting的结果运用用ECL成像系统(MF-chemi BIS3.2, DNR, Israel)采集图像,测定条带光密度值。免疫荧光结果于荧光显微镜(BX61 FL,OLYMPUS, Japan)下观察,用数字CCD成像装置(DP71,OLYMPUS,Japan)采集图像,测定荧光强度(MetaFluor Ver.4.6.5，UIC, USA)。四、统计分析方法采用SPSS for Windows 13.0统计分析软件进行分析,对PRDM14的表达与临床病理特征的关系采用两组资料非参数秩和检验(性别、年龄、组织学类型和淋巴结转移情况)和多组资料非参数秩和检验(TNM分期和分化),PRDM14在细胞系中的表达采用方差分析。P<0.05为有统计学意义。western blotting的光密度值分析采用肺癌组织和癌旁组织配对t检验。P<0.05为有统计学意义。结果一、免疫组化70例肺鳞、腺癌组织中,有8例为PRDM14阴性表达(11.43%),9例为PRDM14弱阳性表达(12.86%),36例PRDM14阳性表达(51.43%),有17例PRDM14强阳性表达(24.29%)(图1)。PRDM14在7例癌旁肺组织中弱表达。PRDM14的表达情况与肺癌的分化程度(P=0.046)和组织学类型(P=-0.047)相关。PRDM14的表达水平与患者的性别(P=0.820)、年龄(P=0.126)、TNM分期(P=0.052)和有无淋巴结转移(P=0.240)关系并不显著。二、Western Blotting42例癌旁组织中33例出现特异性染色条带(64KD),42例肺癌组织中36例出现特异性染色条带(64KD)。对癌旁与肺癌组织的密度值与内对照密度值的比值进行配对T检验,发现癌旁组织与肺鳞癌、腺癌中PRDM14的含量存在显著性差异。PRDM14在肺鳞癌、腺癌中的表达显著高于癌旁肺组织。三、免疫荧光在人支气管上皮HBE细胞系中,PRDM14弱表达。PRDM14在SPC、LTE、A549、460、446、LK2不同肺癌细胞系中表达水平显著高于HBE(P<0.001)。结论在癌旁肺组织中PRDM14弱表达,肺鳞癌和肺腺癌组织中PRDM14较高表达。PRDM14的表达情况与肺癌的分化程度相关,低分化的肺癌PRDM14阳性表达,中高分化的肺癌高表达,这表明PRDM14可能在肺癌发生中起重要作用。在蛋白水平,PRDM14的表达在肺鳞癌和腺癌细胞系中均高于HBE,表达于细胞浆。