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水稻(Oryza sativa L.)是全世界数十亿人口赖以生存的重要粮食作物。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生产中最具毁灭性的真菌性病害。先前的研究表明,稻瘟病抗性基因Pi7被定位于与Pik相同的区域;与Pi7具有“基因对基因”互作的稻瘟病菌无毒基因AvrPi7是与无毒基因AvrPik/km/kp等位或者完全相同的。从上述观点出发,作者推测Pi7也是Pik的等位基因。因此,本研究根据无毒基因AvrPi7的定位和克隆信息,采用与Pik/Pik-p相同的克隆方法对Pi7进行了克隆和功能研究。其主要结果如下:
1.Pi7的抗性特征利用收集自广东、福建、湖南、贵州、四川、辽宁、吉林和黑龙江8省总计497个稻瘟病菌菌株,对携带Pik等位基因的水稻品种进行了抗性测定。结果显示,Pi7的抗谱与Pik等位基因之间存在差异;对广东和四川的稻瘟病菌群体具有较高的抗性。因此,该基因可以用于上述地区的水稻抗病育种计划中。
2.Pi7基因目标区域及候选基因的确定将Pi7的连锁标记整合到Pik/Pik-p/pik-m的遗传物理图谱中,从而确定了Pi7基因的目标区域;并将Pik等位基因的2个候选基因K1和K2确定为Pi7的候选基因(命名为Pi71J2)。
3.候选基因的克隆及功能验证分别利用长片段PCR(long-range PCR,LR-PCR)技术及高保真PCR(highfidelity,HF)技术将Pi7-12从供体(IRBL7-M)基因组DNA中扩增、克隆,并遗传转化到感病受体品种Q1063及龙粳24中;对转基因T0及T1代植株进行抗病表型及基因型鉴定,结果显示,Pi7-12在感病受体品种中实现了稳定的功能互补。由此说明,该候选基因就是Pi7的功能基因。另一方面,利用传统的遗传杂交法,将2个携带Pikp-2 RNAi构建体的纯合稳定RNAi植株(kh4i-11和kh4i-26)与供体品种IRBL7-M进行杂交,并对其杂交F1代植株进行抗病性表型以及基因表达分析。结果显示,F1代植株表现感病,而且其感病性是由于目的基因的表达受到了抑制而导致的。由此说明,Pi7就是Pik的等位基因。
4.Pi7基因的序列及结构特征采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA end,RACE)技术,获得了2个组成基因的全长cDNA序列;Pi7-1和Pi7-2的全长cDNA序列分别为3723 bp和3690 bp,分别编码由1142和1021个氨基酸组成的NBS-LRR类蛋白。将Pi7的cDNA与已克隆的Pik簇抗性基因的cDNA进行比较,确定了Pi7基因的2个特异性的SNP位点;其中一个位于Pi7-1的NBS区域,另外一个位于Pi7-2的LRR区域;通过这2个特异性SNP位点的结合,可以将Pi7与其它Pik等位基因区分开。